ICS 67.050 x 04 GP 中华人民共和国国家标准 GB/T 22943—2008 蜂蜜中三甲氧芒氨嘧啶残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of trimethoprim residues in honey- LC-MS-MS method 2008-12-31发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22943—2008 前言 本标准的附录A、附录 B为资料性附录。 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局 本标准主要起草人：曹彦忠、贾光群、杨志伟、石玉秋、孙海侠、庞国芳。 GB/T22943—2008 蜂蜜中三甲氧苄氨嘧啶残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了蜂蜜中三甲氧苄氨嘧啶残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于蜂蜜中三甲氧氨嘧啶残留量的测定。 本标准的方法检出限为2.0μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 (GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.22004，ISO5725-2：1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987,MOD） 3原理 蜂蜜中残留的三甲氧苄氨啶用磷酸盐缓冲溶液（pH=9）提取，过滤后，经OasisHLBI"柱或相当 的固相萃取柱净化，用甲醇洗脱并蒸干，残渣用流动相溶解，过0.2um滤膜后，样品溶液供液相色谱-串 联质谱仪测定，外标法定量。 4试剂和材料 4.1水:GB/T6682,一级。 4.2甲醇：色谱纯。 4.3 乙：色谱纯。 4.4 磷酸氢二钾（K,HPO·3H,O)：优级纯 4.5 磷酸二氢钾：优级纯。 4. 6 氢氧化钠：优级纯。 4.7甲酸：优级纯。 4.82.0mol/L氢氧化钠：称取8.0g氢氧化钠（4.6），定容至100mL。 4. 9 0.1%甲酸溶液：吸取1.0mL甲酸（4.7），用水稀释至1000mL。 4.10淋洗液：甲醇溶液（2+3）。量取40mL甲醇（4.2)与60mL水混合 4.110.2mol/L磷酸盐缓冲溶液：称取43.86g磷酸氢二钾（4.4)和1.05g磷酸二氢钾（4.5），放人 1000mL烧杯中，加入800mL水溶解，用氢氧化钠（4.6）调至pH值为9.0，再用水定容至1000mL。 4.12流动相：乙-0.1%甲酸溶液（7十13）。 1）OasisHLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 1 GB/T229432008 4.13标准物质：三甲氧氨嘧啶（CAS：738-70-5），纯度≥99% 4.140.1mg/mL标准储备溶液：准确称取适量的三甲氧苄氨嘧啶标准物质（4.13），用甲醇配成 0.1mg/mL的标准储备溶液。标准储备溶液在4℃保存。 4.15标准工作溶液：吸取标准储备溶液（4.14)0.1mL移至10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。该 溶液在4℃保存。 4.16基质标准工作溶液：吸取不同体积标准工作溶液（4.15），用空白样品提取液配成2.0ng/mL、 5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL50.0ng/mL不同浓度的基质标准工作溶液。当天配制 4.17OasisHLB固相萃取柱或相当者：500mg，6mL。使用前依次用5mL甲醇和10mL水预处理， 保持柱体湿润。 4.18滤膜：0.2μm 5仪器 5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪：配有电喷雾离子源。 5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g。 5. 3 氮气浓缩仪。 5.4 液体混匀器。 5.5 固相萃取装置。 5. 6 贮液器：50mL。 真空泵：真空度应达到80kPa。 5.8 pH计。 5. 9 吹干管：10mL。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴 中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温。分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶 中，密封，并做上标记。 6.2试样保存 将试样于常温下保存。 7测定步骤 7.1提取 称取2g试样，精确至0.01g。置于150mL三角瓶中，加人25mL磷酸盐缓冲溶液（4.11)，于液 体混匀器（5.4）上快速混匀1min，使试样完全溶解。 7.2净化 将塞有玻璃棉的玻璃贮液器（5.6）连到OasisHLB固相萃取柱（4.17）上，把样液倒入玻璃贮液器 中，调节流速小于3mL/min，使样液通过OasisHLB固相萃取柱，待样液完全流出后，依次用5mL水 和5mL淋洗液（4.10）洗柱，弃去全部流出液。减压抽干20min，然后用5mL甲醇洗脱，收集洗脱液于 10mL吹干管中。用氮气浓缩仪于50℃吹干。准确加人1.0mL流动相（4.12)溶解残渣，过0.2μm 滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定。 按上述操作步骤，制备用于配制系列基质标准工作溶液的空白样品提取液 2 GB/T22943—2008 7.3测定条件 7. 3. 1 液相色谱参考条件 a) 色谱柱：AtlantisCis，3μm，150mmX2.1mm（内径）或相当者； 流动相：乙睛-0.1%甲酸溶液（7+13）； c) 流速：0.2mL/min; d) 柱温：30℃； e) 进样量：20μL。 7.3.2 质谱参考条件 a) 离子源：电喷雾离子源； b) 扫描方式：正离子扫描； c) 检测方式：多反应监测； d) 电喷雾电压：5500V； e) 雾化气压力：0.076MPa； f) 气帘气压力：0.069MPa； g) 辅助气流速：6L/min； h) 离子源温度：450℃； i) 定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压见表1。 表1定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压 化合物中文名称 化合物英文名称定性离子对（m/2）定量离子对（m/2） 碰撞气能量/V 去簇电压/V 291/230 291/230 35 50 trimethoprim 三甲氧苄氨嘧啶 291/123 40 291/275 35 7.4液相色谱-串联质谱测定 7.4.1定性测定 被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同的试验条件下，样品中待测物质的保留时间与 标准溶液中对应的保留时间偏差在士2.5%之内；且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标 准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表2规定的范围，则可判定样品中存在对 应的待测物。 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以%表示 相对离子丰度K K>50 20<K<50 10<K<20 K≤10 允许最大偏差 ±20 ±25 ± 30 ± 50 7.4.2定量测定 用标准工作溶液（4.16)分别进样，以标准峰面积为纵坐标，以标准工作溶液浓度为横坐标，绘制标 准工作曲线。用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中三甲氧苄氨嘧啶的响应值均应在仪器测定 的线性范围内。在上述色谱条件和质谱条件下，三甲氧芊氨嘧啶的参考保留时间为2.39min。三甲氧 芊氨嘧啶的标准物质多反应监测（MRM)色谱图参见附录A中的图A.1。 本方法的添加平均回收率数据参见附录B中的表B.1。 7.5平行试验 按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定 7.6空白试验 除不称取试样外，均按上述步骤进行。 3