ICS 65. 120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 23187—2008 饲料中叶黄素的测定 高效液相色谱法 Determination of lutein in feeds- High performance liquid chromatography 2009-05-01实施 2008-12-31发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T23187—2008 前言 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。 海区维德生物技术有限公司。 本标准主要起草人：齐德生、于炎湖、陈红、陶正国、高俊勤、邝金媚、辜垂鹏、黄楷彬、孙玉国、 张妮娅。 GB/T23187—2008 饲料中叶黄素的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了高效液相色谱法测定饲料中叶黄素的方法。 5本标准适用于单一饲料、添加剂预混合饲料、浓缩饲料及配合饲料中叶黄素的测定。方法的定量限 为 0. 5 mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987,MOD） GB/T14699.1饲料采样(GB/T14699.1—2005,ISO6497:2002,IDT) GB/T20195动物饲料试样的制备（GB/T20195—2006，ISO6498：1998，IDT） 3原理 试样中叶黄素经碱液皂化及有机溶剂提取后，取上清液过滤，注人高效液相色谱仪进行分离，用紫 外检测器检测，外标法计算叶黄素的含量。 4试剂和材料 除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂，用水符合GB/T6682中一级水的规定 4.1正已烷。 4.2丙酮。 4.3 无水乙醇。 4.4甲苯。 4.5甲醇。 4.6异丙醇。 4.7 氢氧化钾。 4.8 无水硫酸钠 4.9提取剂：正已烷-丙酮-无水乙醇-甲苯（34+23+20+23）混合液。 4.10 4.11硫酸钠溶液（100g/L）：10g无水硫酸钠溶于100mL水中。 4.12叶黄素标准储备液：准确称取叶黄素标准品（含量大于99.0%）2mg（精确至0.1mg），先加入少 量流动相超声溶解，用流动相定容至100mL棕色容量瓶，作标准储备液，4℃避光保存，保存期3天 3叶黄素标准工作液：取叶黄素标准储备液（4.12）用流动相逐级稀释成0.5μg/mL、1.0μg/mL、 4.13 2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL系列标准工作液。 5仪器 5.1恒温水浴锅。 5.2分析天平：感量0.0001g。 5.3高效液相色谱仪：配UV-VIS检测器 1 GB/T23187—2008 5.4旋转蒸发仪。 5.5分液漏斗：250mL。 5.6分析实验室常用玻璃仪器。 6试样的制备 按GB/T14699.1采集有代表性的样品，按GB/T20195进行样品制备。粉碎过0.45mm孔筛，混 合均匀，装人密闭容器中，低温保存备用， 7分析步骤 7.1试样溶液的制备 警告—整个制备过程应避光操作！ 称取试料1g~5g（m），精确到0.0001g，置于100mL棕色容量瓶中。加入30mL提取剂（4.9） 塞紧，旋转振摇1min。加人2mL40%氢氧化钾甲醇液（4.10）于容量瓶中，旋转振摇1min，将容量瓶 接上空气冷凝装置或塞紧瓶塞，置于50℃～60℃水浴中加热20min。于暗处放置1h，加入20mL正 已烷（4.1），旋转振摇1min，加人10%硫酸钠溶液（4.11）50mL，转移到250mL分液漏斗（5.5）中，猛 烈振摇1min，于暗处放置1h，取出上层溶液；水相分别加入20mL正已烷（4.1）提取两次，合并上层 液，于旋转蒸发仪中50℃～60℃水浴浓缩至干，根据样品中叶黄素含量高低，残余物加正已烷（4.1） 10mL～100mL（V），充分溶解后经0.45um滤膜过滤，滤液备用。取20uL滤液在高效液相色谱仪 上测定叶黄素组分的峰面积，根据标准工作曲线（7.2.2)计算滤液中叶黄素的浓度（co）。 7.2测定 7.2.1色谱条件 色谱柱：硅胶柱（5.0μm，250mmX4.6mm）。 流动相：正已烷-乙酸乙酯-异丙醇（73十27+1.5）混合液。 流速:1.5 mL/min。 柱温：室温。 进样量：20μl。 检测器：紫外检测器，使用波长446nm。 7.2.2标准工作曲线的绘制 各取20μL叶黄素标准工作液上机进行高效液相色谱分析。以浓度（c)为横坐标，以峰面积（A）为 纵坐标，做标准工作曲线。 8结果计算 饲料中叶黄素含量X，以质量分数[毫克每千克（mg/kg）]表示，按式（1)计算。 X= CX V :(1) m 式中： co一一由标准工作曲线查得的试样滤液中叶黄素的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； V一加人正已烷的体积（7.1），单位为毫升（mL）； m一一称样量，单位为克（g）。 测定结果用平行测定后的算术平均值表示，结果表示到0.1mg/kg。 9精密度 对同一样品同时或快速连续地进行两次测定，所得结果的相对偏差：叶黄素含量小于或等于 50mg/kg时，不得大于15%；含量大于50mg/kg时，不得大于10%。 2 GB/T23187—2008 5.4旋转蒸发仪。 5.5分液漏斗：250mL。 5.6分析实验室常用玻璃仪器。 6试样的制备 按GB/T14699.1采集有代表性的样品，按GB/T20195进行样品制备。粉碎过0.45mm孔筛，混 合均匀，装人密闭容器中，低温保存备用， 7分析步骤 7.1试样溶液的制备 警告—整个制备过程应避光操作！ 称取试料1g~5g（m），精确到0.0001g，置于100mL棕色容量瓶中。加入30mL提取剂（4.9） 塞紧，旋转振摇1min。加人2mL40%氢氧化钾甲醇液（4.10）于容量瓶中，旋转振摇1min，将容量瓶 接上空气冷凝装置或塞紧瓶塞，置于50℃～60℃水浴中加热20min。于暗处放置1h，加入20mL正 已烷（4.1），旋转振摇1min，加人10%硫酸钠溶液（4.11）50mL，转移到250mL分液漏斗（5.5）中，猛 烈振摇1min，于暗处放置1h，取出上层溶液；水相分别加入20mL正已烷（4.1）提取两次，合并上层 液，于旋转蒸发仪中50℃～60℃水浴浓缩至干，根据样品中叶黄素含量高低，残余物加正已烷（4.1） 10mL～100mL（V），充分溶解后经0.45um滤膜过滤，滤液备用。取20uL滤液在高效液相色谱仪 上测定叶黄素组分的峰面积，根据标准工作曲线（7.2.2)计算滤液中叶黄素的浓度（co）。 7.2测定 7.2.1色谱条件 色谱柱：硅胶柱（5.0μm，250mmX4.6mm）。 流动相：正已烷-乙酸乙酯-异丙醇（73十27+1.5）混合液。 流速:1.5 mL/min。 柱温：室温。 进样量：20μl。 检测器：紫外检测器，使用波长446nm。 7.2.2标准工作曲线的绘制 各取20μL叶黄素标准工作液上机进行高效液相色谱分析。以浓度（c)为横坐标，以峰面积（A）为 纵坐标，做标准工作曲线。 8结果计算 饲料中叶黄素含量X，以质量分数[毫克每千克（mg/kg）]表示，按式（1)计算。 X= CX V :(1) m 式中： co一一由标准工作曲线查得的试样滤液中叶黄素的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）； V一加人正已烷的体积（7.1），单位为毫升（mL）； m一一称样量，单位为克（g）。 测定结果用平行测定后的算术平均值表示，结果表示到0.1mg/kg。 9精密度 对同一样品同时或快速连续地进行两次测定，所得结果的相对偏差：叶黄素含量小于或等于 50mg/kg时，不得大于15%；含量大于50mg/kg时，不得大于10%。 2