ICS 11.220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T23239—2009 伊氏锥虫病诊断技术 Diagnostic techniques for Trypanosomosis evansi 2009-03-09发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T23239—2009 前言 本标准的制定参照了世界动物卫生组织（OIE）编写的《陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物 离鸟与蜜蜂）》（第五版，2004）。 本标准的附录A、附录B和附录C为资料性附录 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中国农业科学院上海兽医研究所 本标准主要起草人：周金林、沈杰 GB/T23239—2009 伊氏锥虫病诊断技术 1范围 本标准规定了新鲜血片、薄血涂片染色、毛细管集虫、实验动物接种等病原鉴定方法和乳胶凝集试 验、间接血凝试验和酶联免疫吸附试验等血清学试验技术。 本标准适用于伊氏锥虫病的诊断、检疫、流行病学调查 2临床诊断 依家畜种类不同，临床症状表现不同。马（骤、驴）一般呈急性经过，感染后，体温突然升高到40℃ 黄牛、水牛及骆驼等一般呈慢性经过，有不定期的间歇发热，食欲不振，消瘦，肿脚和耳、尾干枯症状，许 多慢性感染病例无明显病变。 有以上临床症状者，可以怀疑感染，确诊需要实验室检验。 3病原鉴定 3.1采血样 部血液，处于低虫血症时，外周血检出率常低于深部血的50%。 3.2新鲜血片检查 在干净载玻片上滴上一小滴鲜血，盖上盖玻片，使血液扩散成为细胞单层，再用光学显微镜（200倍） 观察活动锥虫。为防止血液在观察时干凋，也可先在载玻片滴血时加一滴生理盐水或3%柠檬酸三钠 生理盐水。 3.3薄血膜染色检查 将一小滴血放在清洁载玻片一端约20mm处，按常用方法推成薄血膜，迅速风干，用甲醇固定 2min，干燥后，再加姬氏染色液（配法参见附录A）染色25min，倾去染色液，自来水冲洗，干燥后用 400倍~1000倍显微镜检查。 3.4毛细管集虫检查 3.4.1材料准备 肝素处理过的毛细管（管内径1.5mm，长75mm的玻璃或无色透明的硬质塑料管，在拟进血的一 端吸入3%肝素钠10mm，用烤箱70℃～80℃烤干后备用），显微镜一台，离心机一台，载玻片，盖玻 片，12号以上注射针头（或金属针），塑泥（橡皮泥）。 3.4.2采集待检血样 从动物耳静脉或尾静脉穿刺获得血液。先用酒精棉擦净拟采血处皮肤，干后用针头穿刺血管，血流 出时用毛细管吸入达40mm深（即70μL血），封闭未沾染血的另一端（可用塑泥或火焰加热封闭）。 3.4.3集虫 以3000g离心10min，待红细胞全部沉积于毛细管下半部，上层为黄色血浆时即可。 3.4.4检查 在毛细管的血浆与红细胞分界线下1mm处将管折断（切断、剪断），将带有少量红细胞的血浆滴于 载玻片上，盖上盖玻片，使血液扩散成细胞单层。在350倍～400倍放大的光学显微镜下检查活锥虫， 如需进一步详细观察虫体，可再除去盖玻片，晾干血片后，用姬氏染色液染色后，在800倍～1500倍放 大的显微镜下观察确定。 1 GB/T23239—2009 3.5动物接种 采被检动物血0.25mL，加入灭菌阿氏液（或3%柠檬酸三钠生理盐水）0.25mL，经腹腔注射入小 白鼠（大白鼠则加倍量），每周3次从尾部采血检查活寄生虫，为提高锥虫在小鼠体内培养繁殖的敏感 性，可用环磷酰胺或醋酸氢化可的松抑制小白鼠的免疫力。 4血清学试验 4.1乳胶凝集试验 4.1.1材料准备 4.1.1.1器材：乳胶凝集试验反应板，为具黑色背景的玻璃板，用漆或油性色笔将板面分成（20mm~ 30mm）×（20mm~30mm）的方格若干个。25μL移液器（或5μL～200μL可调移液器）或滴管。具 凹井的有机玻璃（或玻璃）血凝反应板 4.1.1.2试剂：化学交联锥虫抗原的乳胶诊断液，锥虫病阳性血清和阴性血清，生理盐水。 4.1.2分析步骤 4.1.2.1用移液器或滴管将生理盐水对被检血清、阳性血清和阴性血清作1：40稀释。 4.1.2.2用滴管在乳胶凝集试验反应板上各方格中分别滴人已被稀释的血清一滴。 4.1.2.3在各方格血清中分别加入同样量的乳胶诊断液，轻轻摇匀，8min内观察结果，室温低于 10℃时需延长2min3min观察，高于30C时需提前2min～3min观察。 4.1.3结果判定 反应液由均匀白色改变为整个液体清亮，并有细小白色凝集颗粒分散其中者为阳性，如仍为均匀白 色则为阴性。如阳性血清未出现阳性反应，或阴性血清出现阳性反应属操作有误或器材准备不合格，需 重做。 4.2间接血凝试验 4.2.1材料准备 4.2.1.1器材：V形（90°角）微量血凝板，10μL、50μL及100μl移液器，温箱。 4.2.1.2试剂：锥虫病间接血凝诊断液，包含抗原致敏血球悬液和非致敏血球悬液；阳性血清或阳性干于 燥血纸；磷酸缓冲液（PBS配法参见附录B)。 4.2.2分析步骤 4.2.2.1先在血凝板写上血清或血纸编号，每份血清取2排各6个孔，上排作测定排，下排为对照排。 4.2.2.2于左边每上排第1孔内加缓冲液200L和血清50μL（5倍稀释），如用血纸则剪取1.2cm² 血纸剪碎，加缓冲液200μL，其浸出液相当血清20倍稀释。然后从每排第2孔开始每孔加人缓冲 液50μL。 4.2.2.3从第1孔内吸取已稀释的血清或血纸浸出液50μuL加人第2孔内，再向右按次序作倍比稀 释，共稀释到160倍（血清）或640倍（血纸）。并吸取第1孔内液50μL加入第2排第2孔内，按同样方 法向右作倍比稀释。最后孔中吸取50uL稀释液丢弃。 4.2.2.4向测定排第2孔至第6孔中各加人致敏血球悬液10μL，向对照排第2孔至第6孔中各加人 非致敏血球悬液10μL（如表1)。 表 1 血清稀释倍数 血清号 10 20 40 80 160 320 640 测定 1 对照 测定 2 对照 2 GB/T23239—2009 表1 (续) 血清稀释倍数 血清号 5 10 20 40 80 160 320 640 测定 3 对照 测定 对照 测定 5 对照 测定 阴性血清 阴性血清 6 对照 缓冲液 缓冲液 4.2.2.5阳性血清也按上述方法操作，另设仅加缓冲液50uL的空白对照孔2个，分别加入致敏和非 致敏血球悬液10μL。 4.2.2.6用微型血凝板振荡器或手指轻拍，将血液悬液与血清稀释液混匀。置于26℃~30℃条件下 1h～2h有一小红色圆点，周围为淡红色毛玻璃状，为阳性，记录为“十十”。红血球大部分沉于孔底中 央，图像为孔底中央有一较大红色圆点，周围有少量面积的淡红色，为弱阳性，记录为十”。红血球全部 沉于孔底中央，图像为孔底中央有一大的红色圆点，周围液体清亮，无淡红色，为阴性，记录为“一”。 4.2.3结果判定 凡测定排阳性反应孔不到1：80稀释时判为阴性，1：80稀释孔及其以上为阳性反应，且测定排比 对照排高出2个稀释度或更多时，该份被检血清判为阳性，仅高出一个稀释度判为可疑。测定排与对照 排阳性反应孔稀释度相同者判为阴性 4.2.4注意事项 4.2.4.1诊断液用时要充分摇匀。 4.2.4.2如到最高稀释度测定排与对照排都是阳性反应时，则应再连续稀释下去。一直稀释到 第12孔为止。 4.2.4.3血纸勿被蝇等昆虫爬舔，未干时也不能重叠。 4.2.4.4移液器在稀释时吸吹次数要一致，测定排与对照排应分别各用一个移液器头子。 4.3酶联免疫吸附试验（ELISA) 4.3.1材料准备 4.3.1.1器材：聚苯乙烯酶标板、酶标仪、5μL～200μL的可调移液器（或25μL、50μL、100μL、 200uL移液器）。 4.3.1.2试剂：锥虫可溶性抗原、辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG抗体、牛血清白蛋白、参考阴性血 清、阳性血清、pH9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液、pH7.4的PBS-吐温缓冲液、pH5.0的柠檬酸盐缓 冲液（以上3种缓冲液配方参见附录C)、邻苯二胺、30%H,O2、2mol/LHzSO4。 4.3.2分析步骤 4.3.2.1用pH9.6的0.05mol/L磷酸盐缓冲液将锥虫抗原液稀释到10μg/mL，向酶标板各孔内加 人200μL，置于2℃~10℃冰箱中20h~24h。 4.3.2.2倒去抗原液，用PBS-吐温缓冲液洗涤3次，每次5min，甩干。用PBS-吐温缓冲液溶解牛血 清白蛋白至1g/20mL，向各孔中加人250uL，置37℃C湿盒内1h 4.3.2.3倒去白蛋白液，同上方法洗涤，甩干。将阴性、阳性血清和被检血清均用PBS液作1：200稀 释，各孔中分别加人200L，每份血清同样加人2个孔。另设空白对照孔2个，只加PBS液。置37℃ 3