ICS 67.050 X 04 GP 中华人民共和国国家标准 GB/T23218—2008 动物源性食品中玉米赤霉醇残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of zeranol residues in animal original food- LC-MS-MS method 2008-12-31发布 2009-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T23218—2008 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：方晓明、盛永刚、王敏、王传现、庞国芳 GB/T23218—2008 动物源性食品中玉米赤霉醇残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了动物源性食品中玉米赤霉醇（zeranol）、β-玉米赤霉醇（β-zearalanol)和玉米赤霉烷酮 (zearalanone)残留量的高效液相色谱-串联质谱的测定方法。 本标准适用于动物肌肉、肝脏、鱼肉、蛋和牛奶中玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇和玉米赤霉烷酮残留量 的测定。 本标准方法检出限为1ug/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.12004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2:1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987，MOD） 3原理 样品经β-葡萄糖苷酸-硫酸酯复合酶水解后，用乙醚提取，提取液经液液分配、HLB固相萃取柱净 化后，用液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。 4试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T6682一级水的标准。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2乙腈：色谱纯。 4.3无水乙醚。 4.4三氯甲烷。 4.5氢氧化钠。 4.6 乙酸钠(NaAc·3H,O)。 4.7 磷酸：纯度大于85%。 4.8冰乙酸。 4.9 0.5mol/L氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠，用水溶解并定容至1L。 4.100.05mol/L乙酸钠缓冲溶液：称取6.8g乙酸钠，用950mL水溶解，冰乙酸调节pH值至4.8， 定容至 1 L。 4.11磷酸溶液（1+4)：10mL磷酸和40mL水混合。 4.12甲醇-水溶液（1+1）：50mL甲醇和50mL水混合。 1 GB/T23218—2008 4.13β-葡萄糖苷酸酶-硫酸酯复合酶：96000U/mLβ-葡萄糖苷酸酶；390U/mL硫酸酯酶（H-2,form helix pomatia)。 4.14玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇和玉米赤霉烷酮标准物质：纯度≥99%。 4.15100μg/mL标准储备溶液：分别准确称取适量标准品（精确至0.1mg），用乙溶解，配制成浓度 为100μg/mL的标准储备溶液。一18℃以下冷冻避光保存。 4.1610ug/mL和1.0μg/mL的混合标准中间溶液：分别准确吸取1.0mL和0.10mL标准储备溶 液（4.15）于10mL容量瓶中，用乙睛定容至刻度，配制成浓度为10μg/mL和1.0μg/mL混合标准中 间溶液。0℃~4℃冷藏避光保存。 4.17基质混合标准工作溶液：根据需要，取适量的混合标准中间溶液（4.16），用空白样品提取液配成 不同浓度的基质混合标准溶液。基质混合标准工作溶液现用现配。 4.18OasisHLB固相萃取柱或相当者：500mg/6mL。使用前分别用5mL甲醇和5mL水预淋洗。 4.19滤膜：0.20μm。 5仪器和设备 5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI)。 5.2 组织捣碎机。 5.3分析天平：感量0.1mg和0.01g。 5.4 移液器：10μL~100μL、100μL~1000uL。 5.5均质器：10000r/min。 5.6涡旋混合器。 5.7 恒温振荡器。 5.8 离心机：4000r/min。 5.9 pH计：测量精度土0.02pH单位。 5.10 氮吹仪。 5. 11 固相萃取装置。 5.12 具塞离心管：50mL。 5.13刻度试管：10mL。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 实验室样品用组织捣碎机绞碎，分出0.5kg作为试样。 6.2试样保存 试样置于一18℃冰箱，避光保存。 7测定步骤 7.1样品处理 7. 1. 1 水解 称取5g试样（精确至0.01g）于50mL具塞离心管中，加入10mL乙酸钠缓冲溶液（4.10）和 0.025mLβ-葡萄糖苷酸-硫酸酯复合酶（4.13），旋涡混匀，于37C水浴中振荡12h。 7.1.2提取 水解后加人15mL无水乙醚，振荡提取5min后，以4000r/min离心2min，将上清液转移至浓缩 1）OasisHLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2 GB/T23218—2008 瓶中，再用15mL无水乙醚重复提取一次，合并上清液，40℃以下旋转浓缩至近干。残留物加1.0mL 三氯甲烷溶解后，转人10mL离心管中，再用3mL氢氧化钠溶液（4.9）润洗浓缩瓶后转移至同一离心 管中，旋涡混匀，以4000r/min离心2min，吸取上层氢氧化钠溶液。再用3mL氢氧化钠溶液（4.9)重 复润洗、萃取一次，合并氢氧化钠溶液，加人1mL磷酸溶液（4.11），混匀后待净化。 7.1.3净化 将样品提取液（7.1.2)转HLB固相萃取柱（4.18）。用5mL水、5mL甲醇-水溶液（4.12）淋洗， 弃去；再用10mL甲醇进行洗脱，收集洗脱液。整个固相萃取净化过程控制流速不超过2mL/min。洗 脱液在40℃以下用氮气吹干。残留物用1.0mL乙睛溶解，旋涡混匀后，过0.2um滤膜，供仪器测 定用。 7.2测定条件 7.2. 1 液相色谱参考条件 a) 色谱柱：Cis，2μm，50mm×2.0mm（内径）或相当者； b) 柱温：40℃； c) 流速：0.2mL/min; d) 进样量：5uL； e) 流动相及梯度洗脱条件见表1。 表1 流动相及梯度洗脱条件 时间/min 乙腈/% 水/% 0 25 75 5 70 30 6 70 30 9 25 75 7.2. 2 质谱参考条件 a) 电离方式：电喷雾电离（ESI)； b) 离子源喷雾电压（IS）：3500V； c) 离子源温度（TEM）：350℃； d) 喷雾气流量：11L/min； e) 扫描方式：负离子扫描； f) 检测方式：多反应监测（MRM），监测条件见表2。 表2多反应监测条件 化合物中文名称 化合物英文名称 母离子(m/α) 子离子(m/ ) 去簇电压/V 碰撞能量/V 277.2 160 17 β-玉米赤霉醇 β-zearalanol 321.1 303.2 160 17 277.2 170 16 玉米赤霉醇 zearalanol 321.1 303.2 170 16 275.1* 170 16 玉米赤霉烷酮 zearalanone 319.1 301.1 170 16 a离子用于定量。 7.2. 3 液相色谱-串联质谱测定 7.2.3.1定性测定 每种被测组分选择一个母离子，两个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间 3