ICS 65.120 B 46 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 23741—2009 饲料中4种巴比妥类药物的测定 Determination of four kinds of barbiturates in feeds 2009-09-01实施 2009-05-12发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 23741—2009 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。 本标准主要起草单位：农业部饲料质量监督检验测试中心（济南） 本标准主要起草人：李俊玲、李会荣、强莉、刘继明、门晓冬、李宏、杨志强 GB/T23741—2009 饲料中4种巴比要类药物的测定 1范围 本标准规定了饲料中巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥的高效液相色谱测定方法和液相 色谱-串联质谱测定法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中4种巴比妥类药物的测定。高效液相色 谱测定方法定量限为1mg/kg，液相色谱-串联质谱方法定量限为0.05mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682一2008，ISO3696：1987，MOD） GB/T14699.1饲料采样（GB/T14699.1—2005,ISO64972002,IDT) GB/T20195动物饲料试样的制备（GB/T20195—2006ISO6498：1998IDT） 3方法原理 蒸干后用甲醇水溶解，在高效液相色谱仪上分离、测定，或在高效液相色谱-串联质谱仪上测定，外标法 定量。 4试剂和材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，实验室用水符合GB/T6682一级水的规定。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2乙睛：色谱纯。 4.3 三氯甲烷。 4.4二氯甲烷。 4.52%甲醇水溶液：取2mL甲醇与98mL水混合。 4.6甲醇水溶液：1+1。 4.7 乙腈水溶液：30十70。 4.8磷酸盐缓冲液：c(NazHPO+NaH,PO,·2H,O)=0.1mmol/L,pH=6.0。称取14.2g的无水 磷酸氢二钠（Na2HPO），加水定容至1000mL，摇匀；另称取15.6g的磷酸二氢钠（NaH,PO： 2H,0），加水定容至1000mL，摇匀。取上述两种溶液按123十877的比例混匀即可。 4.9流动相：甲醇十水=45十55。 4.10巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥标准品：纯度≥99.0%。 4.11标准贮备液：准确称取巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥标准品各25mg，分别用甲醇 （4.1）溶解，定容至25mL，配成浓度为1mg/ml的标准贮备液。2℃～8℃冷藏保存，有效期三个月。 4.12混合标准中间液：准确移取巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比要和司可巴比妥要贮备液（4.11）各5mL， 用甲醇（4.1)定容至50mL，该混合溶液中巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥的浓度均为 100μg/mL。2℃～8℃冷藏保存，有效期一个月。 1 GB/T23741—2009 4.13固相萃取小柱：亲水亲脂平衡固相萃取柱，3mL（60mg）。 4.14 滤膜：0.22μm。 4.15滤纸：快速，12.5cm 5仪器和设备 5.17 高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。 5.2 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。 5.3天平：感量为0.0001g。 5.4氮吹仪。 5.5涡旋振荡器。 5.6固相萃取仪。 6试样制备 按GB/T14699.1采样。选取有代表性饲料样品至少500g，按GB/T20195规定，制备通过 0.45mm实验筛的试样。 7试样处理 7.1提取 称取试料2g（精确至0.0001g）于100mL离心管中，准确加入25mL三氯甲烷（4.3），涡旋振荡 2min，过滤。准确移取滤液15mL于具塞试管中，40℃氮吹至干，加人磷酸盐缓冲液（4.8）3mL，涡旋 溶解，备用。 7.2净化 固相萃取小柱分别用5mL甲醇（4.1）、5mL水、5mL磷酸盐缓冲液（4.8）活化。取上述提取液 （7.1)过柱，再分别用5mL磷酸盐缓冲液（4.8）、5mL甲醇水溶液（4.5）淋洗，空气抽干30min，用 10mL二氯甲烷（4.4)洗脱，收集洗脱液，40℃氮吹至干，准确移取1mL甲醇水溶液（4.6）溶解残渣， 过0.22μm滤膜后待测。 8液相色谱测定 8.1液相色谱条件 色谱柱：Cg柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm，或其他效果等同的Cg柱。 柱温：室温。 进样量：20μL。 流动相：甲醇十水=45十55。 检测器：紫外检测器或二极管阵列检测器 检测波长：215nm。 流速：1.0mL/min。 8.2标准曲线的绘制 取混合标准中间液（4.12）适量逐步稀释，用甲醇（4.1）定容，配制成浓度分别为0.5μg/mL、 1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、50.0μg/mL的混合标准工作液，浓度由低到高进 样，根据峰面积和浓度计算回归方程。4种巴比妥类药物液相色谱条件下标准样品图谱参见图A.1。 8.3定量测定 试料溶液（7.2）上机测定，用单点或多点校准法进行定量。多点校准法定量，根据峰面积的响应值， 从标准曲线中得到待测样中4种巴比妥类药物的浓度（ci）；单点定量，根据样品峰面积的响应值与标准 2 GB/T 23741—2009 溶液峰面积的响应值比值与标准溶液浓度的乘积得到待测样中4种巴比妥类药物的浓度（cir）。 8.4结果计算 试料中4种巴比妥类药物的含量X，以质量分数计，单位为毫克每千克（mg/kg），按式（1)计算： mXVx1000 式中： 试料中某种巴比妥药物色谱峰面积对应的浓度，单位为微克每毫升（ug/mL）； V 加人提取液的总体积，单位为毫升（mL）； V2—一氮吹至干后溶解残渣用甲醇水溶液的体积，单位为毫升（mL）； m—试料的质量，单位为克（g）； 一移取滤液的体积，单位为毫升（mL） Vi- 计算结果保留三位有效数字。 8.5重复性 在同一实验室、由同一操作人员完成的两个平行测定结果，相对偏差不大于10%，以两次平行测定 结果的算术平均值为测定结果。 液相色谱-串联质谱法（仲裁法） 9 9.1液相色谱条件 色谱柱：Cis柱长100mm，内径2.1mm，粒径1.7μm，或其他效果等同的Cis柱； 柱温：40℃； 进样量：5uL； 流动相：乙睛十水，梯度洗脱，见表1； 表1液相色谱-串联质谱流动相梯度洗脱表 时间/min 水/% 乙腈/% 0. 0 70 30 0.5 70 30 1.0 50 50 4.0 20 80 4. 01 70 30 10.0 70 30 流速：0.4mL/min。 9.2质谱条件 离子源：电喷雾离子源； 扫描方式：负离子扫描； 检测方式：多反应监测（MRM)； 毛细管电压：4.0kV； 干燥气温度：350℃； 干燥气流速：10L/min； 雾化气压力：0.241MPa（35psi)； 定性离子、定量离子及对应的保留时间、毛细管出口端电压和碰撞能量见表2。 3