ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 23788—2009 保健食品中大豆异黄酮的测定方法 高效液相色谱法 Determination of soybean isoflavone in health-care food- High-performance liquid chromatography 2009-05-18发布 2009-12-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 23788—2009 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由全国特殊膳食标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位：北京市朝阳区产品质量监督检验所、红牛维他命饮料有限公司、中国食品发酵工 业研究院。 本标准主要起草人：崔岩、邢晓慧、张立刚、钟其顶、张淑玲、郎涛、苏文英、吴镇君、仇凯。 1 GB/T23788—2009 保健食品中大豆异黄酮的测定方法 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了保健食品中大豆异黄酮的测定方法。 本标准适用于以大豆异黄酮为主要功能性成分的保健食品（片剂、胶囊、口服液、饮料），也可用于保 健食品原料中大豆异黄酮含量的测定。 本标准的检出限：固体、半固体样品大豆苷、大豆黄苷、染料木、大豆素、大豆黄素和染料木素组分 的检出限均为5mg/kg；液体样品的大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素组分的 检出限均为0.2mg/L。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987,MOD） 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 大豆异黄酮soybeanisoflavone 大豆昔、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素的总称，黄酮类物质。分子式如下：大豆 苷：C21H20Og，大豆黄苷：C22H22O10，染料木苷：C21H20O10，大豆素：CisHaO，大豆黄素：C16H12Os，染料 木素:C1sH1oOs。 4方法提要 样品制备、提取、过滤后，经高效液相色谱仪分析（C18柱分离），依据保留时间定性，用外标法定量。 5试剂和材料 本标准使用符合GB/T6682规定的一级水。除另有规定仅使用分析纯试剂。 5.1乙睛：色谱纯。 5.2甲醇：优级纯。 5.380%甲醇：用甲醇80mL，加水20mL，混匀。 5.4磷酸。 5.5磷酸水溶液：用磷酸调节pH至3.0，经0.45um滤膜过滤。 5. 6 二甲基亚：色谱纯 5.7 50%二甲基亚砜溶液：取二甲基亚砜50mL，加水50mL，混匀。 5.8大豆异黄酮标准贮备溶液：称取大豆苷（daidzin）、大豆黄苷（glycitin）和染料木苷（genistin）、大豆 1 GB/T237882009 素（daidzein）、大豆黄素（glycitein）和染料木素（genistein）（纯度均为98.0%以上）各4mg，分别置于 10mL容量瓶中，加入二甲基亚砜（5.6）至接近刻度，超声处理30min，再用二甲基亚矾（5.6）定容。各 标准贮备溶液浓度均为400mg/L（大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素）。 5.9大豆异黄酮混合标准使用溶液： 8.0mg/L混合标准溶液配制：吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种 标准贮备溶液（5.8）各0.2mL于10mL容量瓶中，加人等体积水，用50%二甲基亚砜溶液（5.7)定容。 16.0mg/L混合标准溶液配制：吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种 标准贮备溶液（5.8各0.4mL于10mL容量瓶中，加人等体积水，用50%二甲基亚矾溶液（5.7)定容。 24.0mg/L混合标准溶液配制：吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种 标准贮备溶液（5.8）各0.6mL于10mL容量瓶中，加人等体积水，用50%二甲基亚砜溶液（5.7）定容。 32.0mg/L混合标准溶液配制：吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种 标准贮备溶液（5.8各0.8mL于10mL容量瓶中，加人等体积水，用50%二甲基亚砜溶液（5.7)定容。 40.0mg/L混合标准溶液配制：吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种 标准贮备溶液（5.8）各1.0mL于10mL容量瓶中，加人等体积水，用50%二甲基亚矾溶液（5.7)定容。 6仪器和设备 6.1高效液相色谱仪：带紫外检测器（或二极管阵列检测器）。 6.2超声波振荡器。 6.3分析天平：感量0.01mg。 6.4 酸度计：精度0.02pH。 6.5离心机：转速不低于8000r/min。 6.6滤膜：孔径为0.45μm。 6.7容量瓶：10mL。 7分析步骤 7.1样品处理 7.1.1固体样品、半固体样品：固体样品粉碎、磨细（过80目筛）、混匀，半固体样品混匀，称取样品 0.05g~0.5g（精确至0.1mg），用80%甲醇溶液（5.3）溶解并转移至50mL容量瓶中，加入80%甲醇 溶液至接近刻度。 7.1.2液体样品：吸取混匀的液体样品0.5mL~5.0mL于50mL容量瓶中，加人80%甲醇溶液至接 近刻度。 7.1.3将上述样品溶液（7.1.1或7.1.2)用超声波振荡器振荡20min，用80%甲醇定容，摇匀。取样 品溶液置于离心管中，离心机离心15min（转速大于8000r/min）。取上清液用滤膜（6.6）过滤，收集滤 液备用。 7.2色谱条件 7.2.1色谱柱 Cis，4.6mmX250mm，粒度5μm不锈钢色谱柱；也可使用分离效果相当的其他不锈钢柱。 7.2.2流动相 流动相A：乙睛（5.1）。 流动相B：磷酸水溶液（pH=3.0)（5.5）。 7.2.3梯度洗脱条件 见表1。 2 GB/T23788—2009 表 1 时间/min 0 10 23 30 50 55 56 60 流动相A/% 12 18 24 30 30 80 12 12 流动相B/% 88 82 76 70 70 20 88 88 7.2.4流速:1.0 mL/min。 7.2.5波长：260nm。 7.2.6进样量:10μL。 7.2.7柱温：30℃。 7.3测定 7.3.1定性 分别将大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素的标准贮备溶液（5.8）稀释10倍 后，按色谱条件（7.2）进行测定，依据单一标准样品的保留时间，对样品溶液中的组分进行定性，定性色 谱图参见附录A。 7.3.2定量 将大豆异黄酮混合标准使用溶液（5.9）在色谱条件（7.2）下进行测定，绘制以峰面积为纵坐标、混合 标准使用溶液浓度为横坐标的标准曲线。将7.1.3制备的样品溶液注人高效液相色谱仪中，保证样品 溶液中大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素的响应值均在工作曲线的线性范围 内，由标准曲线查得样品溶液中大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素的浓度。 8结果计算 8.1样品中大豆异黄酮各组分［大豆苷（X）、大豆黄苷（X2）、染料木苷（X）、大豆素（X）、大豆黄素 （X，）和染料木素（X.）的含量分别按式（1）计算： Vx1000 X='X (1) 1000 m 式中： X,- 样品中大豆异黄酮单一组分的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）； 根据标准曲线得出的大豆苷（或大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素）的浓度， 单位为毫克每升（mg/L）； V 样品稀释液总体积的数值，单位为毫升（mL）； 固体、半固体样品质量的数值，单位为克（g）； 液体样品体积的数值，单位为毫升（mL）。 8.2样品中大豆异黄酮总含量，按式（2）计算： X= X +X2+X, +X++X, +Xs (2) 式中: X-一样品中大豆异黄酮总含量，单位为毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）； Xi- 样品中大豆苷的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）； X2 样品中大豆黄苷的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）； X3 样品中染料木苷的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）； 样品中大豆素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）； 样品中大豆黄素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）； 样品中染料木素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）。 计算结果应表示到小数点后一位。 9精密度 在重复性条件下，两次独立测定结果之差不得超过算术平均值的10%。