ICS 67.050 x 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 23814—2009 莲蓉制品中芸豆成分定性PCR检测方法 Protocol of the polymerase chain reaction for detecting kidney beans components in lotus foods 2009-05-27发布 2009-09-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T23814—2009 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由中国标准化研究院提出并归口。 本标准负责起草单位：国家加工食品质量监督检验中心（广州）、广州市质量监督检测研究院、中华 人民共和国深圳出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：蔡依军、罩芳芳、罗海英、邓鸿铃、郭新东、吴玉鉴、蓝芳 GB/T23814—2009 莲蓉制品中芸豆成分定性PCR检测方法 1范围 本标准规定了莲蓉制品中芸豆成分的定性PCR检测方法。 本标准适用于由莲蓉制品半成品和成品中芸豆成分的定性检测。 本标准的检出限为0.5ng芸豆DNA。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008,ISO3696：1987,MOD) GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.7转基因产品检测 抽样和制样方法 3术语和定义 GB/T19495.1确立的术语和定义适用于本标准。 4防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。 5抽样和制样 按照GB/T19495.7规定的方法执行。 6测定方法 6.1原理 样品经DNA提取后，针对芸豆特异基因序列设计引物，通过PCR技术，特异性扩增芸豆基因的 DNA片段，根据PCR扩增结果，判断该样品中是否含有芸豆成分。 6.2试剂和材料 除另有规定外，所用试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水。 6.2.1引物：检测莲蓉制品内源基因和芸豆特异基因的引物及其信息见表1。 表1莲蓉制品内、外源基因所需的引物信息 PCR产物大小/ 检测基因 引物序列 基因性质 适用范围 bp 正:5'-GTAGAATCGGCACTGGAGGTAG-3' NNEA0732 142 莲子特异基因 莲蓉制品 反：5*-CATGGGCTAACCAACTAGACAGC-3' 正:5-CAGACATTTCATATCCAGGGAGG-3" AB070627 194 芸豆特异基因 莲蓉制品 反：5'-TGAATTGTACGGTGAAGGATGG-3' 1 GB/T23814—2009 6. 2. 2 琼脂糖：电泳纯。 6.2. 3 Tris饱和酚。 6.2. 4 三氯甲烷。 6.2.5 冰乙酸。 6.2.6 无水乙醇。 6.2.7 异戊醇。 6.2.8 异丙醇。 6.2.9 氢氧化钠（NaOH)。 6.2.10 盐酸(HCI)。 6.2.11 三羟甲基氨基甲烷（Tris）。 6.2.12 乙二胺四乙酸钠盐（Na,EDTA）。 6.2.13 蔗糖。 6.2. 14 漠酚蓝。 6.2. 15 乙酸钠（NaAc）。 6. 2. 16 苯酚十三氯甲烷+异戊醇（25十24十1，体积比）。 6. 2. 17 三氯甲烷十异戊醇（24十1，体积比）。 6.2. 18 3mol/L乙酸钠：3mol/L乙酸钠溶液，乙酸调节pH为5.2。 6.2. 19 1XTAE电泳缓冲液：取50XTAE（242gTris，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/L NazEDTA，用HCI或NaOH调节pH至8.0,定容至1L)按比例稀释。 6.2.20 TE缓冲液：Tris0.01mol/L,NazEDTA0.001mol/L,用HCl或NaOH调节pH至8.0。 6.2.21 PCR试剂盒：Taq酶，dNTPs，10XBuffer，氯化镁（MgCl,）。 6.2.22 上样缓冲液：0.25%漠酚蓝，40%（质量浓度）蔗糖溶液 6.2.23 溴化乙锭溶液：1mg/mL。 6.2.24 70%乙醇。 6.2.25 等效DNA提取试剂盒 6.2.26 DNA分子质量标准品（50bp）。 6.3 主要仪器 6. 3. 1 PCR热循环仪。 6. 3. 2 电泳仪。 6.3.3 凝胶成像系统。 6.3. 4 离心机：12000r/min。 6. 3.5 涡旋振荡器。 6.3.6 分析天平：0.1g。 6.3.7 6.3.8 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.4检测步骤 6.4.1模板DNA的提取 6.4.1.1对照设置 阳性对照：莲子基因组DNA、芸豆基因组DNA； 阴性对照：已知以不含该基因的样品提取的DNA： 空白对照：双蒸水（ddH,O）。 6.4.1.2DNA提取步骤 a）样品DNA提取时设双平行； 2 GB/T 23814—2009 b) 将样品粉碎，取适量样品，加人400μLTE缓冲液（6.2.20），将沉淀完全溶解； c) 加人与溶液等体积苯酚十三氯甲烷十异戊醇（25十24+1)（6.2.16），重复混匀10min； d) 12000r/min室温离心10min，将上清液转移至另一干净的1.5mL离心管中； e) 加入与上清液等体积三氯甲烷十异戊醇（24+1)（6.2.17），重复混匀10min； f) 12000r/min室温离心10min，小心吸取上清液； g) 加人上清液1/10体积3mol/L乙酸钠（6.2.18），加人2倍～2.5倍体积经一20℃预冷的无 水乙醇（6.2.6），颠倒混匀后一20℃静置1h；或加入等体积异丙醇（6.2.8），混匀后室温静置 10 min; h）15000r/min，室温离心10min，弃去上清液； i）70%乙醇（6.2.24）洗涤沉淀2次～3次，干燥DNA； j）50μL0.1×TE(6.2.20)溶解沉淀，4℃保存。 也可以用等效DNA提取试剂盒（6.2.25）提取样品DNA，按试剂盒操作说明书指示操作。 6.4.2DNA质量的测定 样品中提取的DNA质量的测定用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计（6.3.8)进行测定。 取适量DNA溶液加TE缓冲液（6.2.20)进行稀释，用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260nm和280nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按式（1)计算： c=AXNX50/1000 .(1) 式中： DNA浓度，μg/μL; A——260nm处的吸光值； N——核酸稀释倍数。 当A260/A280比值在1.4以上时，可用于PCR扩增，1.7～2.0之间时，PCR扩增效果好。 6.4.3PCR扩增 6.4.3.1PCR反应体系 检测样品内、外源基因的PCR反应体系见表2。每个反应体系应设置两个平行反应。同时设置阳 性对照、阴性对照和空白对照。 表 2PCR反应体系 加入PCR反应体系的体积/ 试剂名称 贮备液浓度 μL 10X PCR Buffer 2. 5 MgCl2 25mmol/L 2.5 dNTP 2.5 mmol/L 2.0 正：0.25 Primers 20 pmol/μL 反：0.25 Taq 5U/μL 0.15 Template 0. 1 μg/ μL~0. 2 μg/ μL 1 O"HPP 补足反应体系总体积为25 6.4.3.2PCR反应循环参数 见表3。 3