ICS 65.020.30 B 44 中华人民共和国国家标准 GB/T 18448.2—2008 代替GB/T18448.2—2001 实验动物 弓形虫检测方法 Laboratory animalMethod for examination of Toxoplasma gondit 2009-03-01实施 2008-12-03发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T18448.2—2008 前言 GB/T18448《实验动物》由10项实验动物寄生虫检测方法组成。 本部分为GB/T18448的第2部分《实验动物弓形虫检测方法》。 本部分自实施之日起代替GB/T18448.2—2001。 本部分与GB/T18448.2—2001相比主要技术差异如下： 增加弓形虫酶联免疫吸附试验（ELISA)和免疫酶染色试验（IEA），将PCR检测方法列入附录 a) 内容，保留间接血凝试验（IHA）作为推荐方法之 ; b) 将检测方法所需的“材料与试剂”和“检测步骤”分别叙述， 本部分附录A是规范性附录。 本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归口。 本部分起草单位：全国实验动物标准化技术委员会 本部分主要起草人：潘振业、屈霞琴、陈俏梅、李冠民、王彦平。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T14926.341994.GB/T18448.22001。 1 GB/T18448.2—2008 实验动物弓形虫检测方法 1范围 本部分适用于小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬及猴等实验动物弓形虫的检测。 2原理 根据免疫学原理，采用弓形虫抗原检测被检动物血清中的弓形虫抗体 3主要试剂和器材 3.1试剂 3.1.1ELISA抗原 3.1.1.1特异性抗原 弓形虫（RH株）速殖子腹腔接种清洁级以上实验小鼠（KM、ICR、BALB/c等均可），3d～5d后，以 无菌生理盐水灌洗被接种小鼠的腹腔，收集含有虫体的小鼠腹腔液，3000r/min离心10min，取沉淀， PBS洗3次。沉淀物加适量蒸馏水反复冻融5次，或用超声波处理后，10000r/min离心30min，取上 清液。上清液用葡聚糖凝胶G200进行纯化（柱内径×柱高：1.5cm×60cm），流速为0.2mL/min。每 管收集2mL左右。共收集60管以上。分别测定每个收集管中蛋白在280nm下的吸光度值。分离纯 化后，出现2个蛋白峰；将第一峰各管合并，即为弓形虫特异性抗原（也称弓形虫可溶性抗原）。 3.1.1.2正常抗原 以无菌生理盐水注射清洁级以上实验小鼠（与制备抗原的小鼠同品种或品系）腹腔，3d～5d后，以 无菌生理盐水灌洗被注射小鼠腹腔，收集小鼠腹腔液，3000r/min离心10min，取沉淀，PBS洗3次 沉淀物加适量蒸留水反复冻融5次，或用超声波处理后，10000r/min离心30min，取上清液，即为正常 抗原。 3.1.2抗原片 弓形虫RH株速殖子腹腔接种清洁级以上实验小鼠（KM、ICR、BALB/c等均可）,3d～5d后处 死，收取虫体，胰酶消化，以一定浓度涂片，充分晾干后冷丙酮固定，一20℃保存。 3.1.3弓形虫抗原致敏绵羊红细胞 将绵羊红细胞与一定浓度的酸液反应，制成化红细胞，然后，用弓形虫可溶性抗原在适宜的条 件下致敏化红细胞，制成弓形虫抗原致敏绵羊红细胞 3.1.4正常对照绵羊红细胞。 3.1.5阳性对照血清 自然感染弓形虫的相应动物抗体阳性血清，或弓形虫免疫血清 3.1.6阴性对照血清 确证无弓形虫感染的动物血清。 3.1.7酶结合物 辣根过氧化物酶标记的抗小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬和猴IgG抗体；或辣根过氧化物酶标记葡 萄球菌蛋白A（SPA)。 3.1.8荧光素结合物 异硫氰氢酸荧光素标记的抗小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬和猴IgG抗体。 1