ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T35939—2018 脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法 Indirect enzyme linked immunosorbent assay for detecting the antibody against encephalomyocarditis virus 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35939—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：南京农业大学、中国动物卫生与流行病学中心。 本标准起草人：白娟、王岩、姜平、蒋康富。 1 GB/T 35939—2018 脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法 1范围 本标准规定了脑心肌炎病毒间接ELISA抗体的检测方法。 本标准适用于猪脑心肌炎病毒抗体的检测、猪脑心肌炎血清流行病学调查和实验室诊断。 注：脑心肌炎疫病简介参见附录A。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 SN/T 2984 检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BSA：牛血清白蛋白(Bovine serumalbumin) ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay） EMCV：脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus) HRP-SPA：辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白（Horseradishperoxidaselabeledstaphylococcal protein A) TMB：四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine) VPl：病毒结构蛋白1(Viralprotein1) 仪器、材料与试剂 4 4.1试验仪器 4.1.1酶联免疫检测仪。 4.1.2高速台式冷冻离心机。 4.1.3微量移液器： 规格0.5μL~10μL20μL~200μL、100μL~1000μL。 4.1.412道可调微量移液器： 规格10μL~100μL。 4.2 2试验材料 4.2.196孔酶标反应板。 4.2.2 注射器（5mL）。 1 GB/T35939—2018 4.2.3微量离心管（1.5mL）。 4.2.4吸头（可与移液器配套）。 4.3 主要试剂 4.3.1 重组EMCVVP1抗原（制备方法见附录B中的B.1)。 4.3.2 EMCV阳性血清和EMCV阴性血清（制备方法见附录B.2）。 4.3.3 HRP-SPA。 4.3.4TMB(见附录C)。 4.3.5商品化EMCV抗体检测试剂盒。 5EMCV间接ELISA抗体检测方法 5.1木 样品采集、运输与保存处理 5.1.1样品要求 按NY/T541采集猪血液，按SN/T2984处理待检猪。另外，按GB19489进行检测。 5.1.2样品采集与运送 采用消毒注射器经猪颈静脉采集血液2mL，若无血清分离条件，待血液凝固后24h内在冷藏条件 下送到实验室。 5.1.3血清分离、保存与运送 取5.1.2凝固血液，2000r/min离心5min，收集上清，放人无菌微量离心管中，用于抗体检测，或 置一20℃保存，并在冻结状态下送往实验室。要求血清清亮，无溶血。 5.2ELISA操作步骤 5.2.1EMCVVP1蛋白包被板的制备： a）抗原包被：用pH9.6抗原包被液（见C.1)将纯化的重组EMCVVP1蛋白稀释成2.0μg/mL， 加入96孔酶标反应板，每孔100μL置37℃2h； 洗涤：弃去孔中液体，加洗涤液洗涤（PBST，见C.5），每孔300μL，洗涤3次，每次3min，洗涤 b) 后甩去孔中液体，最后一次甩掉后，在吸水材料上用力扣磕反应板，但应避免孔壁变干； 封闭：加人含5%脱脂乳粉的PBST，200μL/孔，置37℃下封闭2h； d) 洗涤：同5.2.1b)； 加保护剂溶液：加入抗原保护剂（见C.3），100μL/孔，置37℃下作用1h； f) 密封：置37℃干燥，用锡箔纸真空包装，密封。 5.2.2加被检血清及对照血清：每份被检血清各取4μL，分别加到有196μL稀释液的微量离心管中， 作1：50倍稀释。混勾后分别取100μL依次加人间接ELISA板反应孔中，每份血清加两个孔。每块 反应板设阴性血清和阳性血清（1：50倍稀释）对照各两孔，每孔100μL。盖好包被板置37℃湿盒内孵 育1h。 待检血清样品数量较多时（≥10份），应先使用血清稀释板稀释所有待检血清，再将稀释好的血清 转移到抗原包被板，尽可能使反应时间一致。 5.2.3洗涤同5.2.1b）。 5.2.4加酶标记抗体和孵育：加人PBST稀释工作浓度的辣根过氧化物酶标记的抗体（HRP-SPA） 2 GB/T35939—2018 （1：3000稀释），100μL/孔，37℃孵育0.5h。 5.2.5洗涤同5.2.1b)。 5.2.6加底物缓冲液和孵育：每孔加新配制的底物溶液（见C.6)100μL，37℃避光孵育5min～15min （参见附录D)。 5.2.7终止反应见阳性对照血清孔呈鲜明的蓝色，阴性对照血清孔无色或基本无色，加入2mol/L H,SO4溶液（见C.7)，50μuL/孔，终止反应。 5.2.8 酶标反应板在波长为450nm的酶联免疫吸附仪下读取各孔的OD值，15min内完成 5.3 3结果判定 5.3.1 结果计算 P/N计算，P/N=被检血清的两孔平均ODi50值/阴性对照血清的两孔平均OD450值， 5.3.2判定 阳性对照血清平均OD450值≥0.5，阴性血清两孔平均OD450值≤0.2，判定试验条件成立。 当P/N≥2.1,判为阳性，P/N<2.1则判为阴性 或使用商品化EMCV抗体检测试剂盒，其操作和判定按其说明书进行。 3