ICS 67.050 X 04 GE 中华人民共和国国家标准 GB/T 22949—2008 蜂王浆及冻干粉中硝基咪唑类药物 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination nitroimidazole residues in royal jelly and lyophilized royal jelly farina- LC-MS-MS method 2008-12-31发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22949—2008 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国宁波出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：殷居易、刘永明、谢东华、陈杰、李金、章再婷、范春林、裘定慧、庞国芳、 GB/T22949—2008 蜂王浆及冻干粉中硝基咪唑类药物 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 化甲硝唑、羟基化异丙硝唑、2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑等9种硝基咪唑类药物残留量的液相色谱-串 联质谱测定方法。 本标准适用于蜂产品（蜂王浆、冻干粉及蜂蜜）中硝基咪唑类药物残留量的测定 本标准蜂王浆样品的方法检出限：0.5μg/kg。 本标准冻干粉样品的方法检出限：1.0ug/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准， GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T6379.1- 2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2:1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682一2008，ISO3696：1987，MOD） 3原理 本方法用乙酸钠缓冲液溶解样品基质，乙酸乙酯进行液-液萃取，经过旋转蒸干后，加入四氯化碳和 含酸水溶液，离心后取上层溶液，运用液相色谱串联三重四极杆质谱仪（LC-MS-MS进样检测。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1乙腈：色谱纯。 4.2甲醇：色谱纯。 4.3乙酸乙酯：色谱纯。 4.4甲酸：色谱纯。 4.5四氯化碳。 4.6乙酸钠。 4.7标准品：甲硝唑（metronidazole，缩写MNZ；CAS：443-48-1），地美硝唑（dimetridazole，缩写DMZ； CAS：551-92-8），替硝唑（tindazole，缩写TNZCAS：19387-91-8），洛硝唑（ronidazole，缩写RNZ；CAS： 7681-76-7），特尼哒唑（ternidazole，缩写TerNDZ），异丙硝唑（ipronidazole，缩写IPZ），羟基化甲硝咪唑 （metronidazole-OH，缩写MNZ-OH），羟基化异内硝唑（ipronidazole-OH，缩写IPZ-OH），2-羟甲基-1-甲 基化-5-硝咪唑（2-hydroxymethyl-1-methyl-5-nitro-imidazole，缩写HMMNI），以上标准物质纯度 1 GB/T22949—2008 ≥98%。内标物为氛代2-羟甲基-1-甲基化-5-硝咪唑（HMMNI-D；CAS：8061-52-7），氛代羟基化异丙 硝唑（IPZ-OH-D*；CAS：8061-52-7），氛代物质纯度≥95%。 4.8标准储备溶液：1000μg/mL。准确称取10.0mg士0.05mg各标准物质，用甲醇溶解于10mL棕 液。将储备液置于一20℃冰箱中保存备用。 需浓度，临用临配。 1000mL容量瓶中，超声混合并脱气15min后，于液相色谱流动相瓶中备用。 4.11甲酸水溶液：0.1%。准确移取1mL甲酸，用水定容到1000mL容量瓶中，超声混合并脱气15min 后，于液相色谱流动相瓶中备用。 液（4.9），用空白样品提取液配制成系列浓度的基质混合标准工作液。临用临配。 4.13滤膜：0.2μm。 5仪器 5.1液相色谱-串联三重四极杆质谱仪（LC-MS-MS）：质谱仪配有大气压化学电离源（或与之等效电离 源）；高效液相色谱配有在线脱气机、低残留自动进样器、可控温柱温箱和高精度混合泵。 5.2电子分析天平：感量0.1mg和10mg。 5.3冷冻离心机：速度可达4000r/min和13000r/min 5.4 氮吹仪：水浴和加热控温。 5.5台式分散仪。 5.6 旋转浓缩仪：带真空蒸发和循环冷却水。 超纯水器。 5. 8 超声波清洗器。 5.9多功能食品粉碎机。 5.10mc旋涡混合仪。 5.11鸡心瓶：125mL。 5.12离心管：15mL和50mL；聚四氟乙烯材质。 5.13容量瓶：10mL和1000mL。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 将液体、浆状、粉状的样品充分混合均匀；将低温保存的固体样品进行粉碎磨细后供检测。必要时 将实验室样品用四分法进行缩分。 根据样品的性状和保存要求将样品保存在适当的环境中避免变质。 6.2试样的保存 将试样于一20℃冰箱中保存备用 7测定步骤 7.1提取 称取约2.5g~5.0g试样（蜂王浆称量5.0g土0.2g；冻干粉称量2.5g士0.2g）于50mL离心管 中，分别添加氛代标示物HMMNI-D²、IPZ-OH-D（4.7)100μL，加人20mL乙酸钠缓冲溶液（4.10）充 2 GB/T22949—2008 分涡旋振荡提取1min。 再加人20mL乙酸乙酯，经过涡旋、液-液萃取，将乙酸乙酯层全部移人鸡心旋蒸瓶，重复上述操作， 合并三次乙酸乙酯提取液于鸡心旋蒸瓶，在40C以下浓缩近干，除去溶剂。 7.2净化 鸡心旋蒸瓶残渣用1mL四氯化碳和1mL甲酸水溶液（4.11)溶解，充分涡旋1min。吸取上层水 溶液，用微孔过滤膜（0.2μm）过滤，此为试验溶液。 7.3色谱测定 7. 3. 1 液相色谱参考条件 a) 色谱柱：WatersSunfireODSC1s，5μm，250mmX4.6mm（内径）或相当者； b) 柱温：30℃； c) 流动相：0.1%甲酸水溶液；液相梯度见表1； d) 流速：800μL/min； 进样量：10μL。 e) 表1 液相色谱流动相梯度表 时间/min 流动相A（甲酸水溶液）/% 流动相B（乙睛溶液)/% 流速/(μL/min) 0.00 95 5 800 2.00 95 5 800 6.00 65 35 800 12.00 10 06 800 14.00 10 06 800 15.00 95 5 800 20.00 95 800 7.3. 2 质谱参考条件 a) 离子源：大气压化学电离源（或与之等效电离源）； b) 扫描方式：正离子扫描； c) 检测方式：多反应离子监测（MRM）； d) 电喷雾电压（IS)：5250V； e) 雾化气（NEB)相对开放流量：14.00mL/min； f) 气帘气（CUR）相对开放流量：7.00mL/min； g) 离子源温度（TEM）：500℃； h) 碰撞池出口电压（CXP)：11V； i) 选择离子驻留时间（Dwell)：50ms； j) 碰撞池人口电压（EP)：10.0V； k) 碰撞气（CAD）相对开放流量：8mL/min； 1) 辅助气流压力：413.8kPa； m) 去簇电压（DP）：35V； n) 焦环聚焦电压（FP）：200V； 0) 喷雾器放电针电流（NC)：2μA； p) 检测器参数（正离子化模式），离子流转向电压（DF）：一200.0V；检测器脉冲信号增强电压 (CEM) :2 300.0 V; (b 定性离子对、定量离子对、碰撞气能量、色谱峰保留时间见表2。 3