ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T22950—2008 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中12种β-兴奋剂 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of 12 β-agonists residues in fugu,eel and baked eel- LC-MS-MS method 2008-12-31发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22950—2008 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫 局、食品安全分析与检测技术教育部重点实验室（福州大学）。 本标准主要起草人：杨方、刘正才、林永辉、李耀平、余孔捷、黄杰、陈健、陈国南、庞国芳 GB/T22950—2008 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中12种β-兴奋剂 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中12种β-兴奋剂残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。 特罗（brombuterol）、塞曼特罗（cimaterol）、克仑特罗（clenbuterol）、克仑潘特（clenpenterol）、羟甲基氨 克仑特罗（hydroxymethylclenbuterol）、苯氧丙酚胺（isoxsuprine）、马布特罗（mabuterol）、莱克多巴胺 （ractopamin）、利托君（ritodrine）、沙丁胺醇（salbutamol）、特布他林（terbutaline）和妥布特罗 (tulobuterol)。 本标准中莱克多巴胺、沙丁胺醇、塞曼特罗、克仑潘特和克仑特罗的方法检出限为0.1ug/kg，溴布 特罗、妥布特罗、马布特罗、特布他林、利托君、苯氧丙酚胺和羟甲基氨克仑特罗的方法检出限为 0. 5 μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.12004,ISO5725-1:1994,IDT) 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2：1994，IDT） 3原理 样品经稀酸水解、高氯酸沉淀蛋白后，残留的β-兴奋剂以乙酸乙酯与异丙醇混合溶剂萃取，混合型 阳离子交换反相吸附固相萃取小柱净化，液相色谱-串联质谱进行测定，内标法定量。 4试剂和材料 除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2异丙醇。 4.3乙酸乙酯。 4.4乙腈：色谱纯。 4.5甲酸。 4.6高氯酸。 4.7盐酸。 4.8氢氧化钠。 1 GB/T22950—2008 4.9乙酸铵：色谱纯。 4.10氨水。 4.11氯化钠。 4.1210mol/L氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠至100mL水中，混匀。 4.130.1mol/L高氯酸溶液：移取0.4mL高氯酸至100mL水中，混匀。 4.140.1mol/L盐酸溶液：移取0.85mL盐酸至100mL水中，混匀。 4.155mmol/L乙酸铵溶液：称取0.385g乙酸铵至约800mL水中，加人2mL甲酸，定容至1000mL， 混匀。 4.16甲醇-0.1%甲酸溶液：移取0.1mL甲酸于约50mL水中，加人10mL甲醇，以水定容100mL， 混匀。 4.17标准物质：溴布特罗、塞曼特罗、克仑特罗、克仑潘特、羟甲基氨克仑特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、 莱克多巴胺、利托君、沙丁胺醇、特布他林和妥布特罗，纯度大于98.0%。 4.18内标标准物质：盐酸克仑特罗-D9、盐酸莱克多巴胺-D5、沙丁胺醇-D3，纯度大于98.0%。 4.19标准储备液（100μg/mL）：准确称取适量（精确到0.1mg）的漠布特罗、塞曼特罗、克仑特罗、克 仑潘特、羟甲基氨克仑特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、莱克多巴胺、利托君、沙丁胺醇、特布他林和妥布特 罗，用甲醇分别配制成100μg/mL的标准储备液，一20℃冰箱中保存。 4.20混合标准储备液（1μg/mL）：分别准确量取1.0mL的标准储备液至100mL容量瓶中，用甲醇 稀释至刻度，一20℃冰箱中保存。 4.21内标储备液（100μg/mL）：准确称取适量（精确到0.1mg）的克仑特罗-D9、莱克多巴胺-D5、沙丁 胺醇-D3对照品，用甲醇配制成100μg/mL的标准储备液。 4.22内标工作液（10ng/mL）：分别准确量取适量的同位素内标储备液至同一容量瓶中，用甲醇稀释 定容成浓度为10ng/mL的同位素内标工作液，一20℃下冰箱中保存。 4.23基质标准工作溶液：以空白基质溶液将混合标准储备液与内标工作液稀释至适当浓度，临用 现配。 4.24混合型阳离子交换反相吸附固相萃取柱：60mg/3mL，使用前依次用3mL甲醇和3mL水活 化，保持柱体湿润。 4.25滤膜：0.2μm。 5仪器和设备 5.1高效液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾电离（ESI)源。 5.2天平：感量0.1mg和0.01g。 5.3组织捣碎机。 5.4 高速冷冻离心机：转速可达15000r/min，致冷可达4℃。 5.5 离心机：4000r/min。 5.6 旋涡振荡器。 5.7 电热恒温振荡水槽。 5.8 pH计。 5. 9 旋转蒸发仪。 5.10 固相萃取装置。 5.11 氮吹仪。 6试样制备和保存 6.1试样制备 河豚鱼、鳗鱼取连皮的鱼肉，将皮、肉分离后取鱼皮置于微波炉中加热后连同鱼肉、鳗鱼制品取所有 2 GB/T22950—2008 可食部分一并放入组织捣碎机均质，充分混匀，装人清洁容器内，并标明标记 制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 6.2试样保存 试样于一18℃以下保存，新鲜或冷冻的组织样品可在2℃～6℃贮存72h。 7测定步骤 7.1提取 准确称取5g（精确到0.01g）测试样品于50mL聚丙烯离心管内，加人50μL10ng/mL的内标 物，加入20mL0.1mol/L盐酸溶液（4.14），涡旋混匀，于37℃下避光水浴振荡16h（过夜），取出冷却 至室温，加人5mL0.1mol/L高氯酸溶液（4.13），涡旋混匀，4℃下15000r/min离心10min，分取 10mL上清液转移至另一50mL离心管内。用10mol/L氢氧化钠溶液（4.12）调节pH值至9.7土 0.3，加人约2g氯化钠后，再加25mL异丙醇-乙酸乙酯（3+2），涡动提取2min，4500r/min离心 5min，取出上清液至另一50mL离心管中。再在下层水相中加15mL乙酸乙酯-异丙醇（7十3），涡动 提取1min，4500r/min离心5min，合并有机相，40C下旋转蒸发至近干，加入5mL0.1mol/L盐酸 溶液（4.14），涡动1min，待净化。 7.2净化 40℃下以氮气吹至近干，以0.5mL甲醇-0.1%甲酸溶液（4.16）溶解，涡动混匀，过0.2um滤膜 （4.25），供液相色谱-串联质谱仪测定。 7.3空白基质溶液的制备 称取阴性样品5g（精确至0.01g），按7.1和7.2步骤操作。 7.4液相色谱-串联质谱测定 7.4.1液相色谱条件 色谱柱：AcquityUPLCBEHCis，1.7μm,55mmX2.1mm(内径)或相当者； b) 流动相：A为5mmol/L乙酸铵溶液（4.15），B为0.1%甲酸乙睛，梯度洗脱，洗脱程序见表1； 表1梯度洗脱程序 时间/min A/% B/ % 0. 0 85 15 1. 0 85 15 2.0 30 70 2. 5 30 70 3. 0 85 15 5.0 85 15 c) 流速：0.25mL/min； d) 柱温：30℃； e) 进样量：10μL。 7. 4. 2 质谱条件 a) 离子源：电喷雾源（ESI），正离子模式： 扫描方式：多反应监测（MRM)； c) 毛细管电压：1.5kV； 3