ICS 67.050 x 04 GR 中华人民共和国国家标准 GB/T22954—2008 河豚鱼和鳗鱼中链霉素、双氢链霉素 和卡那霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of streptomycin,dihydrostreptomycin and kanamycin residues in fugu and eel LC-MS-MS method 2009-05-01实施 2008-12-31发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22954—2008 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局 本标准主要起草人：刘晓茂、张守军、张进杰、曹彦忠、杨志伟、曹亚平、庞国芳 GB/T22954—2008 河豚鱼和鳗鱼中链霉素、双氢链霉素 和卡那霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 方法。 本标准适用于河豚鱼和鳗鱼中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量的测定 本标准方法的检出限：链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的检出限均为10.0μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.12004.ISO5725-1:1994.IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2:1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682一2008，ISO3696：1987，MOD） 3原理 河豚鱼或鳗鱼试样中的抗生素用磷酸溶液提取，三氯乙酸沉淀蛋白，用苯磺酸型和羧酸型固相萃取 柱净化。液相色谱-串联质谱仪（ESI+）检测，外标法定量 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为优级纯。 4.1水:GB/T6682，一级。 4.2甲醇：色谱纯。 4.3乙睛：色谱纯。 4.4甲酸。 4.5浓磷酸。 4.6 磷酸氢二钾（K,HPO）。 4.7 三氯乙酸（C,HCl,Oz）。 4.8庚烷磺酸钠(C,HisNaO,S·H,O)。 4.95%磷酸溶液（1+19）：取50mL浓磷酸（4.5），用水定容至1L。 4.100.2mol/L磷酸盐缓冲溶液：pH=8.5。称取34.8g磷酸氢二钾（4.6）用水溶解，定容至1L，用 氢氧化钠溶液调节pH=8.5。 4.11三氯乙酸溶液：50%，质量分数。取20g三氯乙酸（4.7），用水定容至20mL。 4.120.01mol/L庚烷磺酸钠溶液：称取2.20g庚烷磺酸钠（4.8），用水溶解，定容至1L。 1 GB/T22954—2008 4.13SPE洗脱溶液：取4mL甲酸（4.4），用0.01mol/L庚烷磺酸钠溶液（4.12）定容至100mL。 4.1425%甲醇溶液（1+3）：取25mL甲醇（4.2），用水定容至100mL。 4.15标准物质：链霉素（CAS：3810-74-0）、双氢链霉素（CAS:128-46-1）和卡那霉素（CAS:25389-94-0）； 纯度均≥98%。 4.161.0mg/mL标准储备溶液：称取适量的链霉素、双氢链霉素和卡那霉素标准物质（4.15），分别用 0.3%乙酸水溶液溶解并配制成1.0mg/mL的标准储备溶液。避光保存于一18℃冰柜中。 4.170.1ug/mL混合标准溶液：吸取适量链霉素、双氢链霉素和卡那霉素标准储备溶液（4.16），用 0.3%乙酸水稀释成0.1ug/mL的混合标准溶液，避光保存于一18℃冰柜中。 4.18苯磺酸型固相萃取柱（500mg，3mL）或相当者。使用前依次用5mL甲醇和10mL水预处理， 保持柱体湿润。 4.19羧酸型固相萃取柱（500mg,3mL）或相当者。使用前依次用5mL甲醇和10mL水预处理，保 持柱体湿润。 4.20滤膜：0.2μm。 5仪器 5.1 液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源， SZIC 5. 2 分析天平：感量0.1mg和0.01g。 5. 3 液体混匀器。 5.4固相萃取装置。 5. 5 均质器。 5.6 真空泵：真空度应达到80kPa。 5.7 微量注射器：25μL，100uL。 5.8 pH计：测量精度士0.02pH单位。 5.9 具塞离心管：100mL。 5.10 0刻度离心管：5ml。 5.11 液器：50mL。 5.127 离心机：转速4000r/min以上。 6试样的制备与保存 6. 1 试样的制备 实验室样品混合均匀，分出0.5kg作为试样。 6.2试样保存 试样置于一18℃冰柜，避光保存。 7测定步骤 7.1待测样品溶液的制备 7.1.1样品提取和初净化 称取河豚鱼或鳗鱼样品10g（精确到0.01g），置于100mL离心管中，加人30mL5%磷酸溶液 （4.9），均质3min，并用5%磷酸溶液清洗均质器刀头合并洗涤液，加人3mL三氯乙酸溶液（4.11）涡旋 混合后在4000r/min下离心10min。上清液全部倒人下接苯磺酸型固相萃取柱（4.18）的贮液器中， 在固相萃取装置上使样液以小于2mL/min的流速通过萃取柱，待样液全部通过固相萃取柱后，依次用 5mL5%磷酸溶液（4.9）和10mL水洗涤苯磺酸型固相萃取柱（4.18），弃去全部流出液。用20mL磷 酸盐缓冲溶液（4.10）洗脱至50mL离心管中。 2 GB/T 22954—2008 7.1.2样品溶液再净化 上述洗脱液倒人下接羧酸型固相萃取柱（4.19）的贮液器中，在固相萃取装置上使样液以小于 2mL/min的流速通过萃取柱，待样液全部通过固相萃取柱后，依次用10mL水和10mL25%甲醇溶液 （4.14)洗涤羧酸型固相萃取柱（4.19），弃去全部流出液。减压抽干羧酸型固相萃取柱（4.19）30min。 过0.2um滤膜（4.20），供液相色谱-串联质谱测定。 7.2基质混合标准校准溶液的制备 混合标准溶液（4.17)，制成链霉素、双氢链霉素和卡那霉素含量均为5.0μg/kg、10.0ug/kg、20.0μg/kg、 100.0ug/kg和200.0μg/kg的基质标准溶液。其余按7.1步骤操作完成。 7.3测定条件 7.3. 1 液相色谱参考条件 a) 色谱柱：AtlantisCi8，3.5μm，150mmX2.1mm（内径）或相当者； b) 柱温：40℃； 进样量：30μL； c) d) 流动相：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙溶液，流动相C为甲醇。 梯度洗脱参考条件见表1。 表 1 液相色谱梯度洗脱参考条件 时间/min 流速/(μL/min） 流动相A/% 流动相B/% 流动相 C/% 0 200 85 10 5 3.01 200 60 35 5 6.00 200 60 35 5 6.01 200 85 10 5 16.00 200 85 10 5 7.3.2 质谱参考条件 a) 离子源：电喷雾离子源（ESI）； b) 扫描方式：正离子扫描； c) 检测方式：多反应监测（MRM）； d) 电喷雾电压（IS)：5000V； e) 辅助气（AUX）流速：7L/min； 辅助气温度（TEM)：550℃； 聚焦电压（FP）：150V； g) h) 链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的质谱参数见表2。 表2链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的质谱参数 定性离子对 定量离子对 去簇电压(DP)/ 采集时间/ 碰撞能量(CE)/ 化合物名称 (m/2) (m/2) V ms V 链霉素 582/263 45 582/263 110 100 (streptomycin) 582/246 55 双氢链霉素 584/263 43 584/263 100 100 (dihydrostreptomycin) 584/246 55 卡那霉素 485/163 34 485/163 50 100 (kanamycin) 485/324 23 3