ICS 71.040.40;13.060.70 G 76 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T263222010 工业循环冷却水中亚硝化菌的测定 MPN 法 Examination of nitrite bacteria in industrial circulating cooling water- MPN test 2011-01-04发布 2011-12-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T26322—2010 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国石油和化学工业联合会提出。 本标准由全国化学标准化技术委员会水处理剂分会（SAC/TC63/SC5)归口。 本标准负责起草单位：中海油天津化工研究设计院、广州市特种承压设备检测研究院。 本标准主要起草人：张全、李琳、黎华、滕厚开、杜玉辉。 I GB/T26322—2010 工业循环冷却水中亚硝化菌的测定 MPN法 1范围 本标准规定了工业循环冷却水中亚硝化菌的测定方法。 本标准适用于工业循环冷却水中亚硝化菌的测定，也适用于原水、生活用水及黏泥中亚硝化菌的 测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备（GB/T603—2002ISO6353-1：1982， NEQ) GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987，MOD） 3方法提要 在28℃～30℃下，恒温培养试样14d后，先采用格里斯氏（Griess）试剂定性判断亚硝化菌的存 在。如果溶液呈红色，表明为阳性反应；如果溶液未呈红色，表明为阴性反应。再采用MPN技术对被 测试样中的亚硝化菌进行计数。 4试剂和材料 4.17 本标准所用试剂，除非另有规定，应使用分析纯试剂和符合GB/T6682中三级水的规定。 试验中所需制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T603之规定制备。 4. 2 硫酸铵。 4.3 碳酸钙。 4. 4 磷酸二氢钠。 4.5 磷酸氢二钾。 4.6 硫酸锰(MnSO·4H,O)。 4.7 硫酸镁（MgSO4：7H,0）。 4.8 对氨基苯磺酸。 4.9 α-萘胺。 4.10 盐酸溶液：1+11。 4.11 乙酸溶液（10%）。 4.12 氢氧化钠溶液：40g/L。 4.13 乙醇溶液：体积分数为75%。 4.14牛皮纸。 1 GB/T26322—2010 4.15 医用脱脂纱布。 4.16 6医用脱脂棉。 5 仪器、设备 5. 1 无菌箱（室）或超净工作台。 5. 2 蒸汽压力灭菌器。 5. 3 生化培养箱。 5. 4 电热干燥箱：温度可控制在60℃~280℃ 5.5 刻度吸管：1mL。 5.6 刻度吸管：10mL。 5.7 试管：d20mmX200mm。 试管架。 5.8 5.9 磨口试剂瓶：1000mL。 5.10 容量瓶：1000mL。 5.11 糖瓷量杯：1000mL。 5.12 白色比色瓷板。 6 试验前准备 6.1无菌稀释水的制备 6.1.1生理盐水的配制：称取8.5g氯化钠，溶解在1000mL水中，混匀。 6.1.2将生理盐水分装在d20mmX200mm的试管中，每管9mL，塞上棉塞，用牛皮纸把试管口包 好，用蒸汽压力灭菌器于（121士1）℃灭菌15min30min。 6.2富集培养基的制备 称取下列试剂： 硫酸铵 (NH4),SO4 2.0 g; NaH,PO, 0. 25 g; 磷酸二氢钠 磷酸氢二钾 K,HPO, 0.75 g; 碳酸钙 CaCO3 5.0 g; 硫酸锰 MnSO4: 4H,0 0.01 g; 硫酸镁 MgS04: 7H20 0.03 g. 将上述试剂加水约950mL，在电炉上加热溶解后，趁热用四层医用脱脂纱布过滤于糖瓷量杯中。 用热水补充至1000mL，用氢氧化钠溶液调节pH值至7.0~7.2,并分装在d20mm×200mm的试管 中，每管10mL，塞上棉塞，用牛皮纸把管口包好。十个一捆，用蒸汽压力灭菌器于（121士1）℃灭菌 15 min~30 min。 6.3指示剂的制备 格里斯氏（Griess)试剂 A液：对氨基苯磺酸0.5g，乙酸溶液（10%）150mL，保存在棕色瓶中。 B液：α-萘胺0.1g，水20mL，乙酸溶液（10%）150mL，保存在棕色瓶中。 2 GB/T26322—2010 6.4刻度吸管的灭菌 6.4.1将洗净并烘干后的吸管粗端塞上医用脱脂棉，棉花量要适宜，长度大约10mm~15mm，棉花 不宜露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉。 6.4.2每支刻度吸管用一条约40mm～50mm宽的牛皮纸条，以45°左右螺旋形卷起来，吸管的尖部 在头部，粗端将多余的纸条折叠打结，不使散开，标上量度，若干支扎成一束，置电热干燥箱中，于（160士 2℃灭菌2h。 6.5采样瓶的灭菌 将洗净并烘干后的1000mL磨口试剂瓶瓶口和瓶颈用牛皮纸包好，扎紧，置电热干燥箱中，于 (160±2)℃灭菌2h。 7测定步骤 燃无菌箱（室）内的酒精灯。试样的稀释和接种操作应在无菌箱（室）内的火焰区进行。 7.2用10倍稀释法稀释试样。即用1mL无菌刻度吸管吸取1mL待测试样注人到9mL无菌稀释 水管中，充分摇匀，此时稀释度为10-1。 摇匀，此时稀释度为10-²，以此类推，直至需要的稀释度为止。 7.4将水样（包括稀释水样）分别接种于装有培养基的试管中，试管置试管架上，每个稀释度重复接种 5管（也可根据需要重复接种3管或4管），每管接种1mL，每接种一个稀释度更换一支无菌吸管。 7.5另取一组试管培养基不接水样，作为空白 7.6培养：在生化培养箱中于28℃30℃恒温培养14d。 8计数与报告 8.1取出少量培养液（约5滴）于白色比色瓷板小窝中，依次加人格里斯氏（Griess)试剂A液和B液各 两滴（格里斯氏试剂A液和B液应按顺序加人）。如果溶液呈红色，则表示有亚硝化菌存在，以“十”（阳 性）表示；如果溶液未呈红色，则表示无亚硝化菌存在，以“一”（阴性）表示。 8.2如果空白出现阳性反应，说明测定过程中有污染，本次测定无效。 8.3计算出10进位稀释管中阳性试管数，以阳性组合指数记录下来。 8.4在10进位稀释中多于3个稀释度时，阳性组合的指数只需要用其中依次的3个稀释度，对这3个 稀释度的选择原则是先选出5管全部阳性反应的最大稀释度，然后选出其次相连的2个更高的稀释度， 计算出阳性组合指数（见表1中示例1、示例2、示例4）。 8.5若按照8.4规定的原则选出3个稀释度后，有更高的稀释仍然产生1个阳性试管，就应将这一阳 性试管并入所选择的最高稀释的阳性结果中（见表1中示例3）。 8.6根据阳性组合的指数，查附录A中表A.1得出最大可能菌数（MPN)除以阳性组合指数的第一位 数字的稀释度数，即为每毫升水样中亚硝化菌的菌数（如果每个稀释度重复接种4管或者3管，根据阳 性组合的指数查附录B中表B.1或附录C中表C.1)。 3