ICS 65.120 CCS B 20 团 体 标 准 T / N A I A 0 2 6 —2 0 2 1T/ NAIA 0220-2023 青贮饲料中9种真菌毒素的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of 9 Mycotoxins in silage Liquid chromatography-mass spectrometry 2023-08-28发布 2023-08-31实施 宁夏化学分析测试协会 发 布 发布TB 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规 则》的规定起草。 本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。 本文件起草单位 ：宁夏农产品质量标准与检测技术研究所、宁夏食品检测研究院、宁夏 回族自治区吴忠市利通区农业服务中心、宁夏化学分析测试协会。 本文件主要起草人 ：刘霞、赵子丹、王晓静、李冬、杨春霞、王晓菁、张学玲、开建荣、 牛艳、杨静、吴燕、苟春林、陈翔、李彩虹、陈嘉龙、张锋锋、纪立香、王芳、张艳、张小 飞。 本文件为首次发布。 全国团体标准信息平台 1青贮饲料中 9种真菌毒素的测定 液相色谱 -质谱 /质谱法 1 范围 本文件规定了 青贮饲料中伏马毒素 FB1、伏马毒素 FB2、伏马毒素 FB3，脱氧雪腐镰刀 菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇 、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇、 玉米赤霉烯酮 、黄曲 霉毒素 AFB1、黄曲霉毒素 AFB2 共9种真菌毒素测定的液相色谱 -质谱 /质谱分析方法。 本文件适用于青贮技术处理的饲料中 9种真菌毒素测定 。如青贮玉米 、青贮苜蓿 ，青贮 农作秸秆，其它类型青贮饲料可参考本文件。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期 的引用文件， 仅该日期对应的版本适用本文件 ；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所 有的修改单）适用于本文 件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验 方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样用 0.1%甲酸乙腈溶液提取，经混合净化材料萃取净化后，取适量上清液经氮气吹 干后乙腈水溶液定容，经超高效液相色谱 —串联质谱法测定，外标法定量。 5 试剂与材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水符合 GB/T 6682中规定的一级水。 5.1 乙腈（ CH 3CN）：色谱纯。 5.2 甲醇（ CH 4O）：色谱纯。 5.3 氯化钠（ NaCl）：分析纯。 5.4 无水硫酸镁（ MgSO4）：分析纯。 5.5 柠檬酸钠（ C6H5O7Na3）：分析纯。 5.6 柠檬酸二钠盐（ C6H6Na2O7）：分析纯。 5.7 0.1%甲酸 80%乙腈溶液（ 8+2，体积比）： 取20mL水加入 80mL乙腈中混匀， 加入 0.1%甲酸。 5.8 50%乙腈溶液（ 5+5，体积比）： 取50 mL水加入 50mL乙腈中混匀。 5.9 毒素标准品 ：伏马毒素 FB1（CAS号116355-83-0 ，纯度 ≥98 %）、伏马毒素 FB2（CAS 号116355-84-1 ，纯度 ≥97.9 %）、伏马毒素 FB3（CAS号136379-59-4 ，纯度 ≥98.5 %）、脱 全国团体标准信息平台 2氧雪腐镰刀菌烯醇 （CAS号51481-10-8 ，纯度≥ 99.38 %）、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇 （CAS 号50722-38-8 ，纯度≥ 99.0 %）、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇 （CAS号88337-96-6 ，纯度≥ 99.8 %）、玉米赤霉烯酮（ CAS号17924-92-4 ，纯度≥ 99.7 %）、黄曲霉毒素 AFB1（CAS 号1162-65-8 ，纯度≥ 99.0 %）、黄曲霉毒素 AFB2（CAS号7220-81-7 ，纯度≥ 99.0 %）。 5.10 标准溶液配制：根据需要分别吸取适量 9种真菌毒素标准溶液， 用乙腈稀释成 1.0 μg/mL混合标准溶液， -18 ℃下保存。 6 仪器与设备 6.1 高效液相色谱 -质谱 /质谱仪：配有电喷雾离子源（ ESI）。 6.2 分析天平： 感量 0.01 g和0.0001 g。 6.3 高速万能粉碎机： 10000 r/min。 6.4 振荡器。 6.5 离心机： 4000 r/min。 6.6 涡旋混合器。 6.7 氮吹仪。 6.8 离心管： 50 mL，塑料。 6.9 滤膜： 0.22 μm，有机相。 7 分析步骤 7.1 试样的制备 青贮饲料样品于 -18 ℃冷冻冰箱中保存 。试验时将青贮样品取出 ，用高速万能粉碎机粉 碎，分别置于样品袋中， -18 ℃冷冻备用。 7.2 试样提取与净化 称取青贮饲料样品 2.00 g（精确至 0.01 g）于50 mL离心管， 加入 20.00 mL提取液 （5.7），振荡提取 40 min，于4000 r/min离心 3 min，吸取 6.00 mL上清液于盛有 2g无水 硫酸镁、0.5g柠檬酸钠 、0.5g柠檬酸二钠盐的 15 mL离心管中 ，涡旋净化 1min，于4000 r/min 离心 3 min，吸取 3.00 mL于15 mL离心管中，经氮气吹干后， 用1.5mL 定容液（ 5.8）溶 解，涡旋 30 s，过0.22 μm滤膜后，上机测定。 8 液相色谱 —串联质谱法测定 8.1 液相色谱参考条件 a）色谱柱： T3柱， 100 mm×2.1 mm，粒径 1.8 μm，或性能相当者。 b）柱温： 40 ℃。 c）进样量： 2 μL。 全国团体标准信息平台 3d）流动相、 流速及梯度洗脱条件见表 1。 流动相 A：水溶液（ 含0.1%甲酸 +5mmol/L 乙酸铵）； 流动相 B：甲醇（ 含0.1%甲酸）。 表1 流动相、流速及梯度洗脱参考条件 时间， min 流速， mL/min 流动相 A，% 流动相 B，% 0 0.4 90 10 1.0 0.4 85 15 2.0 0.4 80 20 6.0 0.4 40 60 10.0 0.4 17 83 11.0 0.4 90 10 13.0 0.4 90 10 8.2 质谱参考条件 a）离子源：电喷雾离子源。 b）扫描方式：正离子模式和负离子模式。 c）离子源喷雾电压： 正离子模式 5500V、负离子模式 4500V。 d）离子源温度： 550℃。 e）雾化气、气帘气、碰撞气、辅助加热气均为高纯氮气，使用前应调节各气体流量以 使质谱灵敏度达到检测要求。 f）检测方式：多反应监测， 参数详见表 2、表3。 表2 ESI+监测模式分析参数 名称 保留时间 /min 定性离子对 /m/z 定量离子对 /m/z 碰撞能量 /eV 伏马毒素 FB1 8.45 722.4/334.4 722.4/352.4 722.4/334.4 54 50 伏马毒素 FB2 9.69 706.4/336.51 706.4/318.61 706.4/336.51 50 54 伏马毒素 FB3 9.15 706.4/336.50 706.4/318.60 706.4/336.50 50 50 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 3.82 297.1/249.1 297.1/203.2 297.1/249.1 16 21 3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌 烯醇 6.07 339.2/203.2 339.2/231.1 339.2/203.2 21 18 15-乙酰脱氧雪腐镰刀 菌烯醇 6.07 339.3/321.2 339.3/137.1 339.3/321.2 12 19 黄曲霉毒素 B1 7.42 313.1/285.1 313.1/241.1 313.1/285.1 33 50 全国团体标准信息平台 4黄曲霉毒素 B2 7.19 315.1/287.1 315.1/259.1 315.1/287.1 35 40 玉米赤霉烯酮 9.74 317.1/175.0 317.1/273.0 317.1/175.0 -32 -27 8.3 色谱测定与确证 根据试样中被测物的含量情况 ，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析 。标准工作 液和待测样液中毒素的响应值均应在仪器线性响应范围内。在上述仪器条件下， 伏马毒素 FB1、伏马毒素 FB2、伏马毒素 FB3，脱氧雪腐镰刀菌烯醇 、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇 、15- 乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇 、玉米赤霉烯酮、 黄曲霉毒素 B1、黄曲霉毒素 B2的保留时间分 别约为 8.45、9.69、9.15、3.82、6.07、6.07、7.42、7.19、9.74min，多反应离子监测色谱图 参见附录 A。按照上述条件进行样品测定 ，若检测样品的色谱峰保留时间与标准品一致 ，且 与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致 ，相对丰度允许偏差不超过表