ICS 19.020;07.100.01 G 76 中华人民共和国国家标准 GB/T39303—2020 废水处理系统微生物样品前处理 通用技术规范 General technical specification for pre-treatment of microorganism samples in wastewater treatment system 2021-10-01实施 2020-11-19发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 IG GB/T393032020 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国石油和化学工业联合会提出 本标准由全国化学标准化技术委员会（SAC/TC63）归口。 本标准起草单位：南京大学、南京大学宜兴环保研究院、南京江岛环境科技研究院有限公司、中海油 天津化工研究设计院有限公司、蓝保（厦门）水处理科技有限公司、东莞理工学院、国网天津市电力公司 电力科学研究院、石家庄给源环保科技有限公司、珠海京工检测技术有限公司 本标准主要起草人：任洪强、何席伟、张徐祥、白莹、吕奋勇、牛军峰、苏展、耿金菊、李永广、王庆、 王磊、吴兵。 GB/T39303—2020 废水处理系统微生物样品前处理 通用技术规范 1范围 本标准规定了废水处理系统中微生物样品的现场处理、微生物菌种分离与保藏、微生物样品宏基因 组DNA提取以及微生物样品的保存 本标准适用于采用生物处理工艺（活性污泥法工艺和生物膜法工艺）的废水处理系统中微生物样品 的现场处理、提取与保存。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 HJ91.1污水监测技术规范 SN/T2632微生物菌种常规保藏技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 微生物样品 microorganism samples 遗传物质；以及包含上述菌株和遗传物质的废水处理系统中的进出水样品、活性污泥样品、生物膜样 品等。 3.2 前处理 pre-treatment 在开展废水处理系统微生物研究工作之前对采集的各种微生物样品所进行的各种处理。 3.3 宏基因组 metagenome 不经菌株分离筛选步骤，直接从环境样品中提取的遗传物质（DNA或RNA），包含了样品中所有微 生物的遗传信息 [GB/T30744—2014,定义3.1.6] 缩略语 4 下列缩略语适用于本文件。 CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrimethylammoniumbromide) DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid) EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid） 1 GB/T39303—2020 LB：肉汤培养基（Luria-bertani） OD:光密度（Optical density) RNase A:核糖核酸酶A SDS：十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate） TE：Tris-HCI和EDTA-2Na配成的缓冲液 Tris：三羟甲基氨基甲烷（2-Amino-2-hydroxymethyl-1，3-propanediol) 16SrRNA基因：细菌染色体上编码核糖体RNA16S亚基的基因 18SrRNA基因：真核生物染色体上编码核糖体RNA18S亚基的基因 5试剂或材料 5.1本标准所用试剂和水，除非另有规定，应使用分析纯试剂和电阻率大于18Mα·cm的超纯水。 5.2无水乙醇。 5.3异丙醇。 5.4盐酸溶液：1mol/L。量取83mL盐酸，缓慢加人917mL水中，混匀。 5.5氢氧化钠溶液：40g/L。 5.6童 重铬酸钾溶液：5g/L。 5.7SDS溶液:100g/L。 5.8 生理盐水：称取9gNaCl.溶于1L水中。混匀后在高压火菌锅中121℃C灭菌20min（简称灭菌处 理)。 乙醇溶液：50%。 5.10乙醇溶液：75%。 5.11 1/3000孟加拉红溶液（玫瑰红水溶液）：称取1g孟加拉红溶解于3L水中。 5.12 链霉素溶液：0.3g/L。 5.13Tris-HCl贮液：1mol/L。称取121.14gTris，溶解于800mL水中，用盐酸溶液调节pH值至 8.0，加水稀释至1L。 5.14Tris-HCI溶液：移取10.00mLTris-HCI贮液置于1L容量瓶中，用水稀释至刻度。 5.15DNA抽提缓冲液：称取37.3gEDTA-2Na、17.8g磷酸氢二钠（Na2HPO,·2HzO)、15.6g磷酸 二氢钠（NaH,PO，·2HzO)87.8g氯化钠和10gCTAB,溶解于700mL水中，加人100mLTris-HCI 贮液，用盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节pH值至8.0，加水稀释至1L后灭菌处理。 5.16TE溶液：称取0.373gEDTA-2Na，溶解于800mL水中，加人10mLTris-HCl贮液，用氢氧化 钠溶液调节pH值为8.0，加水稀释至1L后灭菌处理。 5.17酚-氯仿-异戊醇溶液：将500mLTris饱和酚、480mL氯仿和20mL异戊醇溶液混合均匀，贮存 于棕色玻璃瓶中，4℃可保存两周。 5.18LB培养基：称取10g蛋白陈，5g酵母膏，10g氯化钠，18g琼脂粉溶解于1L水中，混匀后灭菌 处理。 5.19高氏一号培养基：称取20g可溶性淀粉，1g硝酸钾，0.5g磷酸氢二钾，1g硫酸镁（MgSO4· 7H,O),0.01g硫酸亚铁，溶解于1L水中，用氢氧化钠溶液调节pH值至7.2～7.4。加人10mL重铬 酸钾溶液，再加入18g琼脂粉，混匀后灭菌处理。 解于800mL水中，加人100mL1/3000孟加拉红溶液，再加入18g琼脂粉，混匀后灭菌处理。冷却至 50℃~60℃时，加人100mL链霉素溶液，混匀。 5.21溶菌酶贮液：10g/L。称取1g溶菌酶，溶解于100mLTris-HCl溶液。于一20℃保存。 5.22RNaseA贮液：10g/L。称取1gRNaseA，0.09gNaCl,溶解于100mL预先用盐酸溶液调节 2 GB/T39303—2020 pH值至7.5的Tris-HCl溶液，于100℃加热15min，按每管1mL分装，于一20℃保存。 5.23无菌滤膜：直径47mm，孔径为0.22μm或0.45μm的混合纤维素酯滤膜。 5.24离心管：材质为聚丙烯。 6仪器设备 6.1 真空泵：真空度大于或等于一80kPa，空载流量大于或等于20L/min。 6.2 砂芯过滤器：滤头直径为50mm，接收瓶体积为500mL~1000mL的砂芯过滤器 6.3 超低温冰箱：最低保存温度为一80℃。 6.47 高速冷冻离心机：配有50mL离心管。温度调节范围4℃~20℃，转速0r/min~18000r/min。 6.5# 振荡培养箱：温度调节范围0℃~60℃，转速0r/min~300r/min。 6.6 生化培养箱：温度调节范围0℃~60℃。 6.7 高压灭菌锅：温度可升至121℃，压力可维持0.1MPa~0.15MPa。 超净工作台：洁净度级别100级。 6.9 恒温水浴锅：温度调节范围室温～99℃。 6.10光学显微镜：放大倍数40×~2000×。 6.11 微量移液枪：100μL~1000μL。 6.12 涡旋仪：转速0r/min~3000r/min。 6.13 超微量紫外分光光度计：波长范围200nm850nm。 7样品的现场处理 7.1一般规定 7.1.1样品的现场处理包括样品的分装、固定与现场保存，样品包括水样、活性污泥样品以及生物膜 样品。 7.1.2采样前应了解废水处理系统的处理工艺、废水类型和废水排放规律等情况，并按HJ91.1的规定 进行采样。 7.1.3用于分样和装样的器具均应灭菌处理，如现场条件无法实现，应用75%乙醇溶液擦拭后使用。 7.2水样的现场处理 7.2.1用于菌种分离的水样处理 将无菌滤膜置于砂芯过滤器内，使用真空泵对水样进行抽滤。滤膜的过水量视水样的浑浊程度而定， 样过滤应于2h内完成。过滤后，将滤膜放入50mL离心管中，于1℃～5℃保存。 7.2.2用于宏基因组DNA提取的水样处理 7.2.2.1按7.2.1操作将水样进行过滤处理，过滤后，将滤膜放入50mL离心管中，于一20℃保存。 处理。 7.3活性污泥样品的现场处理 7.3.1用于镜检或菌种分离的活性污泥样品处理