ICS65.020.30 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T36194—2018 金鱼造血器官坏死病毒检测方法 Detection method of goldfish haematopoietic necrosis virus 2018-12-01实施 2018-05-14发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36194—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口。 本标准起草单位：全国水产技术推广总站、中国检验检疫科学研究院、北京出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：李清、王娜、谷强、张曼、景宏丽、吴绍强、张利峰、江育林、陈浩楠， 1 GB/T361942018 金鱼造血器官坏死病毒检测方法 1范围 本标准规定了金鱼造血器官坏死病毒（鲤疱疹病毒2型）的PCR检测、荧光PCR检测和综合判定 方法。 本标准适用于金鱼造血器官坏死病毒的鉴定，用于金鱼造血器官坏死病毒引起的相关疾病的流行 病学调查、诊断、检疫和监测。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 3 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CyHV：鲤疱疹病毒（cyprinidherpesvirus） CyHV-2：鲤疱疹病毒2型（cyprinidherpesvirus2) GFHNV：金鱼造血器官坏死病毒（goldfishhaematopoietic necrosisvirus) dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate） bp:碱基对(base pair) Ct：循环阈值（cyclethreshold） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammoniumbromide） EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid) Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane 试剂和材料 4. 除非另有说明，仅使用分析纯试剂。 4.1水：应符合GB/T6682中一级水的规格。 4.2TaqDNA聚合酶：5U/μL。-20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。 4.3 dNTP:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmoL/L，一20℃保存。 4.4 引物：浓度为10μmoL/L，一20℃保存。 a）CyHV引物 1)CyHVpol-F:5'-CCCAGCAACATGTGCGACGG-3 2)CyHVpol-R:5'-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3 1 GB/T36194—2018 3）扩增CyHV(1型、2型和3型）DNA聚合酶基因中362bp的片段 b) CyHV-2引物 1) CyHV-2Hel-F:5'-GGACTTGCGAAGAGTTTGATTTCTAC-3 2)CyHV-2Hel-R:5'-CCATAGTCACCATCGTCTCATC-3 3）扩增CyHV-2解旋酶基因中366bp的片段。 荧光PCR用引物和探针 1）正向引物：5'-TCGGTTGGACTCGGTTTGTG-3' 2）反向引物:5'-CTCGGTCTTGATGCGTTTCTTG-3 3）探针:5'-FAM-CCGCTTCCAGTCTGGGCCACTACC-BHQ1-3' 4.5 5无水乙醇：使用前预冷到一20℃。 4.6 琼脂糖：电泳纯。 4.7 4.8 荧光PCR2×预混合液（2×supermix）：一20℃保存。 5 器材和设备 SA 5.1 生物安全柜。 5.2 2超低温冰箱及普通冰箱。 5.3 离心机及离心管。 5.4 高压灭菌锅。 5.5 5组织研磨器。 6PCR仪。 5.6 5.7电泳仪。 5.8荧光PCR仪。 5.9 凝胶成像仪。 临床症状 6 参见附录A。 7采样 7.1 采样部位 采集待测鱼的鳃、脾、肾等。 7.2 采样数量 采样数量应符合SC/T7103的要求。 7.3 样品采集 按GB/T18088的规定执行，且体长≤4cm的鱼苗取整条，若是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊；4cm< 体长<6cm的鱼苗取所有内脏；体长≥6cm的鱼则取鳃、脾、肾。成熟雌鱼还需取卵巢液；鱼卵则取 卵膜。 2 GB/T36194—2018 8病毒的检测 8.1设立对照 从提取样品DNA起，均需设立阳性样品对照、阴性样品对照和空白对照。取已知阳性样品的组织 作为阳性对照，取GFHNV检测阴性的组织作为阴性对照，取等体积的无菌去离子水作为空白对照 8.2DNA抽提 取25mg100mg样品，加150μLCTAB溶液（见B.1），将样品匀浆，转人1.5mL的离心管中， 再加CTAB溶液至900μL。25℃作用2h~2.5h。 在含有样品的离心管中加入600uL抽提液I（见B.2），充分混合不少于30s。12000r/min，4℃， 离心5min，取上层水相（约800μL），再加人700μL抽提液IⅡl（见B.3），充分混合至少30s。12000r/min， 4℃，离心5min，取上层水相（约600μL），再加一20℃预冷的1.5倍体积的无水乙醇（约900uL），颠 20uL水溶解，用作PCR模板。 也可使用同等抽提效果的商品化试剂盒或其他方法抽提病毒DNA。 8.3PCR检测 8.3.1反应体系 在PCR管中依次加人：10×PCR缓冲液（含Mg+）5μL、dNTP1μL、正向和反向引物各1μL、 TaqDNA聚合酶0.5μL，模板2.5μL，加水至总体积为50μL。瞬时离心，将反应管置于PCR仪 8.3.2反应条件 94℃预变性5min：94℃1min、55（CyHV引物）或60℃（CyHV-2引物）1min、72℃1min，扩 增35个循环；72℃延伸10min，最后4℃保温。 8.3.3琼脂糖电泳 用1X电泳缓冲液（见B.5）配制2%的琼脂糖凝胶（含0.5μg/mLEB，见B.6，或其他等效商品化试 剂）。将5μL样品和1μL6X上样缓冲液（见B.7）混匀后加人样品孔，在电泳时设立DNA标准分子量 作对照。5V/cm电泳约0.5h，当溴酚蓝到达底部时停止，将凝胶置于凝胶成像仪上观察。 8.3.4测序 取PCR产物进行基因序列测定，将测序结果与DNA序列数据库（GenBank）中参考序列（参见附录 C)进行同源性比对。 8.3.5结果判定 利用CyHV引物进行PCR扩增后，阳性对照会出现362bp的特异性条带，阴性对照和空白对照均 没有该条带。待测样品扩增出362bp的条带，且基因序列测定结果与参考序列相似性在99%以上者， 可判定待测样品PCR检测结果为阳性；未扩增出条带或条带大小不是362bp均判定为PCR检测结果 阴性。 利用CyHV-2引物进行PCR扩增后，阳性对照会出现366bp的特异性条带，阴性对照和空白对照 均没有该条带。待测样品扩增出366bp的条带，且基因序列测定结果与参考序列相似性在99%以上 3 GB/T36194—2018 者，可判定待测样品PCR检测结果为阳性；未扩增出条带或条带大小不是366bp均判定为PCR检测 结果阴性。 8.4 荧光PCR检测 8.4.1反应体系 在PCR管中依次加人：2X预混合液（2Xsupermix）6.25μL、正向和反向引物各0.5μL、探针 0.5μL、模板2.5μL、加水至12.5μL。瞬时离心，将反应管置于荧光PCR仪 8.4.2反应条件 95℃2min95℃30s.58℃45s72℃45s，共40个循环；72℃延伸2min。 8.4.3结果判定 阴性对照和空白对照应无Ct值，阳性对照Ct值<35，且出现S型典型扩增曲线，否则此次检测视 为无效，应重新检测。 待测样品Ct值35且出现典型扩增曲线，可判定为荧光PCR阳性；若待测样品无扩增曲线，或 Ct值≥40，可判定为荧光PCR阴性。 对于35<Ct值<40的样品，应进行重复检测。若重复检测的Ct值≤35且出现典型扩增曲线，可 判定为荧光PCR阳性；否则判为荧光PCR阴性。 9综合判定 同时满足以下两条即可判定为GFHNV阳性： 利用CyHV引物PCR检测结果为阳性，且测序结果正确。 利用CyHV-2引物PCR检测结果为阳性，且测序结果正确。 荧光PCR结果为阳性。 4 GB/T 36194—2018 附录A （资料性附录） 金鱼造血器官坏死病 A.1疾病描述 由金鱼造血器官坏死病毒（goldfishhaematopoieticnecrosisvirus，GFHNV）引起金鱼、鲫等鱼类死 亡的一种病毒性传染病，在全球多个国家和地区均有流行。1992年秋季和1993年春季，在日本西部养 殖的金鱼发生金鱼造血器官坏死病大流行，死亡率达100%。此后，其他国家或地区相继出现有关该病 的报道，包括美国、英国、澳大利亚和捷克共和国等。在中国江苏等地也发生了该病，造成严重死亡。 A,2 宿主 金鱼、异育银鲫及鲫的其他变种。对鱼卵、鱼苗、鱼种和亲鱼均可感染，危害严重。 A.3水温 该病发生的最适水温为20℃左右。 A.4临床症状 患病鱼主要表