ICS 65.020 B 61 中华人民共和国国家标准 GB/T35880—2018 银耳菌种质量检验规程 Regulations for quality inspection of tremella culture 2018-09-01实施 2018-02-06发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T35880—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华全国供销合作总社提出。 本标准由全国银耳标准化工作组（SAC/SWG9）归口。 本标准起草单位：全国银耳标准化工作组、福建农林大学生命科学学院、古田县食用菌研发中心、古 田县食用菌产业管理局。 本标准主要起草人：张琪辉、温志强、雷银清、余新敏、龚宽俊、金珊珊、彭冬祥、林铃。 1 GB/T35880—2018 银耳菌种质量检验规程 1范围 本标准规定了银耳菌种质量检验的术语和定义、抽样、检验内容与方法、质量要求、判定规则。 本标准适用于银耳菌种质量的检验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T29368银耳菌种生产技术规范 GB/T30989高通量基因测序技术规程 NY/T1284 食用菌菌种中杂菌及害虫的检验 3 术语和定义 GB/T29368界定的以及下列术语和定义适用于本文件。为了便于使用，以下重复列出GB/T29368 中的 可一些术语和定义。 3.1 银耳菌种 tremella culture 生长在适宜基质上具有结实性的银耳菌丝和香灰菌丝的混合培养物。 注：包括银耳母种、银耳原种和银耳栽培种 3.2 银耳母种 stockcultureof tremella 经混合培养或基内分离得到的具有结实性的银耳菌丝和香灰菌丝的混合培养物。 注1：改写GB/T29368—2012，定义3.10。 注2：也称银耳一级种。 3.3 银耳原种 mother spawnoftremella 由银耳母种移植、繁殖的培养物。 注：也称银耳二级种。 3.4 银耳栽培种 spawn of tremella 由银耳原种移植、繁殖的培养物。 注：也称银耳三级种。 3.5 银耳菌种真实性 genuineness of tremella culture 同时含有银耳菌丝和香灰菌丝的菌种。 1 GB/T35880—2018 3.6 银耳菌种活力 tremella culture activity 银耳菌种生长、繁殖、形成子实体的能力。 3.7 白毛团 mycelium pellet 银耳菌丝与香灰菌丝混生在培养基表面形成的白色菌丝团。 ［GB/T29368—2012,定义3.4] 3.8 银耳菌丝体 myceliumof tremella 由许多银耳菌丝联结在一起组成的营养体 注：银耳菌丝颜色白至黄色，纤细，具分枝及分隔，锁状联合明显 3.9 香灰菌丝体 mycelium of cohabitant fungus 由许多香灰菌丝联结在一起组成的营养体。 3.10 漆酶 laccase 含四个铜离子的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶，以单体糖蛋白的形式存在。 注：漆酶存在于菌类、植物中，亦可存活于空气中，以其独特的催化特性，被广泛应用于生物检测。 4抽样 4.1抽样方法 采用随机抽样法。银耳母种、银耳原种、银耳栽培种的抽样数量（瓶、袋）分别以每批生产的菌种数 量（以每天的生产数量为一批）为单位，按式（1)计算抽样数量。 N ...(1) 式中： n—抽样数量； N——每批数量。 计算结果保留整数。 4.2 2样品的运输与保藏条件 样品在运输过程中容器内的温度应控制在18℃～23℃，湿度自然；待检样品应放置在18℃~ 23℃，湿度自然的环境中，24h内检测；保留样品应放置在18℃～23℃，湿度自然的环境中保藏备查， 保藏时间20天。 检验内容与方法 5.1 仪器设备和试剂 5.1.1仪器设备 5.1.1.1 放大镜：10倍。 2 GB/T 35880—2018 5.1.1.2 体视显微镜：50倍。 5.1.1.3 ：灭菌锅：最大温度可达126℃，最大压力可达0.155MPa。 5.1.1.4 恒温水浴锅：土1℃。 5.1.1.5 高速冷冻离心机：转速可达10000r/min。 5.1.1.6 超净工作台：洁净等级100级@≥0.5μm。 5.1.1.7 PCR仪。 5.1.1.8 电泳仪：可电压6V~600V，电流4mA~400mA 5.1.1.9 凝胶成像系统。 5.1.1.10 紫外可见分光光度计。 5.1.2 试剂 除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的三级水 5.1.2.1 三羟甲基氨基甲烷。 5.1.2.2 二水合乙二胺四乙酸钠。 5.1.2.3 盐酸。 5.1.2.4 氢氧化钠。 5.1.2.5 氯化钠。 5.1.2.6 三甲基溴化铵。 5.1.2.7 聚乙烯吡咯烷酮。 5.1.2.8 氯仿。 5.1.2.9 异戊醇。 5.1.2.10 饱和酚。 5.1.2.11 乙醇。 5.1.2.12 核糖核酸酶（RNase酶）。 5.1.2.13 硼酸。 5.1.2.14 引物ITS4。 5.1.2.15 引物ITS5。 5.1.2.16 PCR扩增缓冲液（10X，pH8.3）。 5.1.2.17 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP)。 5.1.2.18 Taq DNA聚合酶(1.5 U)。 5.1.2.19 核酸染料。 5.1.2.20 分子标记(DNAmarker)：2000bp。 5.1.2.21 琼脂糖。 5.1.2.22 重蒸水：应符合GB/T6682规定的二级水及以上标准。 5.2感官检验 母种、原种、栽培种感官检验内容和方法如表1所示。 3 GB/T35880—2018 表1母种、原种、栽培种感官检验内容和方法 检验内容 菌种级别 检验方法 菌种容器外观 菌丝体外观 母种 菌种瓶和标签的完整性；菌种瓶塞 白毛团、香灰菌、子实体生长 用眼晴观察、鼻闻、手触摸，必要 原种 状态 （盖）的松紧度、干燥度、清洁度、气 时用放大镜或体视显微镜观察 味、杂菌、害虫和其他污染物 栽培种 白毛团、香灰菌生长状态 5.3杂菌及害虫检验 母种、原种、栽培种的杂菌及害虫检验按照NY/T1284的规定进行。 5.4真实性检验 5.4.1DNA的提取 母种、原种、栽培种DNA的提取，按照附录A的方法进行。也可以采用DNA提取试剂盒进行，要 求得到的DNA浓度不低于50ng/μL，1.7<A260/A280<2.0，琼脂糖凝胶电泳结果条带清晰不拖尾。 用TE缓冲液将DNA浓度稀释到50ng/μL~100ng/μL。 5.4.2ITS序列分析 银耳菌种ITS序列分析按照附录B的方法进行。 5.5活力检验 银耳菌种活力检验按照附录C的方法进行。 6质量要求 6.1感官 母种、原种、栽培种感官要求应符合表2的规定。 表2母种、原种、栽培种感官要求 菌种级别 菌种容器外观 菌丝体外观 标签应注明品种名称、菌种 白毛团应结实圆润；香灰菌丝爬壁呈羽毛状，分泌的黑色素均匀无杂色； 母种 级别、接种日期、保藏条件、 无桔抗线；原基表面分泌液清澈透明；子实体耳片整齐、无异状 保质期、菌种生产单位名称 白毛团应结实圆润；香灰菌丝爬壁呈羽毛状，分泌的黑色素均匀无杂色； 原种 等：菌种瓶应无破损；菌种 无拮抗线：原基表面分泌液清澈透明：子实体耳片整齐、无异状 瓶塞（盖）应干燥、洁净、无 脱落、无异味、无杂菌、无害 培养基表面出现许多小而紧实圆润的白毛团；香灰菌丝生长健壮、分布 栽培种 虫和其他污染物 均勾、呈羽毛状：无拮抗线 6.2杂菌及害虫 银耳菌种杂菌及害虫检验应同时符合以下规定： 4 GB/T 35880—2018 用放大镜观察，培养物表面没有光滑、润湿的黏稠物；菌种瓶塞（盖）处或培养基面没有与正常 a) 颜色不同的霉菌斑点，没有害虫的卵、幼虫、蛹或成虫； b) 用显微镜观察，培养物没有不同粗细菌丝或异样孢子存在，没有害虫的卵、幼虫、蛹或成虫： NA培养液清澈无浑浊，PDA培养的菌种菌丝生长速度、菌落特征、孢子特征与正常菌种 一致。 6.3 3真实性 母种、原种、栽培种真实性应符合以下规定： ITS序列分析过程中，电泳结果同时出现535bp和910bp两条片段，且测序结果满足其中 a) 535bp的片段序列和银耳的ITS序列相似性达98%以上；其中910bp的片段序列和香灰菌 的ITS序列相似性达99%以上。银耳和香灰菌的ITS序列参见附录D； b) 银耳菌种同时含有银耳ITS标记和香灰菌ITS标记。 6.4漆酶活力 母种、原种、栽培种的漆酶活力应符合表3的规定。 表3母种、原种、栽培种漆酶的酶活力指标 菌种级别 母种 原种 栽培种 酶活力/(U/L) >2.78 >5.56 ≥1.39 7 判定规则 7.1合格菌种 感官、真实性、杂菌及害虫、活力均符合要求的为合格菌种。 7.2不合格菌种 感官、真实性、杂菌及害虫、活力若有一项不符合要求即为不合格菌种。 5