ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36847—2018 兰花褐斑病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Acidovorax cattleyae 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36847—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国甘肃出人境检验检疫局、中华人民共 和国二连浩特出人境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境 检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局 本标准主要起草人：赵文军、王溪桥、张永宏、田茜、寸东义、廖芳、历艳 GB/T368472018 兰花褐斑病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了兰花褐斑病菌的分离培养、免疫学及分子生物学等检测鉴定方法。 本标准适用于兰花植株中兰花褐斑病菌的检疫鉴定及该病害的田间调查与监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 SN/T1157进出境植物苗木检疫规程 3兰花褐斑病菌的基本信息 中文名：兰花褐斑病菌，兰花细菌性褐斑病菌 学名:Acidovorar cattleyae（Pavarino1911)Schaad et al.2009 异名:Acidovorar avenae subsp.cattleyae(Pavarino 1911)Willems et al.1992 Pseudomonas cattleyae (Pavarino 1911)Savulescu 1947 Bacillus cattleyae(Pavarino)Stapp 1928 Bacterium cattleyae Pavarino 191l Phytobacterium cattleyae (Pavarino)Magrou&.Prevot1948 Phytomonas cattleyae (Pavarino) Ark &.Thomas 1946 英文名：Bacterial brown spot of orchid 分类地位：细菌域Bacteria，变形菌门Proteobacteria，β-变形菌纲Betaproteobacteria，伯克氏菌目 Burkholderiales，丛毛单胞菌科Comamonadaceae，嗜酸菌属Acidovorar。 传播途径：远距离传播主要靠带菌种苗，近距离传播主要借助叶面浇水、喷雾或施肥而将病原菌散 播至健康植株上，通过叶片伤口及自然孔口侵染，造成二次感染。 兰花褐斑病菌的其他信息参见附录A。 4原理 根据兰花褐斑病菌与抗体之间的特异性反应，对植株或叶片进行免疫学检测；根据兰花褐斑病菌的 特异性DNA序列进行分子生物学检测；根据兰花褐斑病菌的培养性状、生物学特性、寄主范围及危害 症状等对病原菌进行分离培养及致病性测定。 5 仪器设备及主要试剂 5.1仪器设备及用具 PCR仪、实时荧光PCR仪、显微镜、超净工作台、恒温培养箱、灭菌锅、制冰机、高速冷冻离心机，台 1 GB/T36847—2018 式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、量筒、烧杯、培 养皿、PCR管、离心管、接种环、玻璃棒、剪刀等。 5.2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。分子生物学检测所需试剂见附录B和附录C。 金氏B培养基配制方法：多聚蛋白陈20g，甘油10g，七水硫酸镁1.5g，琼脂15g，加双蒸水至 1000mL，调节pH至7.2,湿热灭菌（121℃,15min）。 6田间观察检测 6.1症状观察 状，对出现典型症状或可疑症状的植株进行拍照记录，并采集表现症状植株送实验室进行检测鉴定，田 间无症状植株可随机采样。 6.2现场检测 7实验室检测 7.1样品制备 对于有症状的样品，低倍显微镜下观察病健交界处组织有无溢菌现象，若有溢菌现象，用灭菌剪刀 剪取新鲜病叶上的病健交界处（对于无症状样品，随机选取植物组织），在75%乙醇或含有效氯1%的次 氯酸钠溶液中表面消毒50s～60S，无菌水清洗3次，然后将其移至灭菌培养血中，加适量无菌水，用灭 菌镊子或剪刀将病组织捣碎，静置5min～10min，即制成组织悬浮液，用于分离培养、免疫学检测及分 子生物学检测。 7.2免疫学检测 利用商品化的ELISA检测试剂盒进行检测，按照说明进行操作及结果判定。 7.3分子生物学检测 7.3.1模板制备 按照7.1的方法制备成样品悬浮液后，直接用商业化植物基因组DNA提取试剂盒按照操作说明提 取样品总DNA，一20℃保存备用。 对于分离培养得到的疑似菌株，可直接或经裂解处理后（97℃沸水浴10min；12000r/min离心 10min，取上清液，一20℃保存）作为分子生物学检测反应模板。 根据实验室条件，可选择下列任一方法（7.3.2或7.3.3）进行检测 7.3.2PCR凝胶电泳检测 对于叶片等植株样品，以已知带菌的兰花植株组织作阳性对照（若无已知带菌材料，可用模拟带菌方 式代替），以健康的兰花植株组织作阴性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照，对待测样品进行PCR凝 胶电泳检测。对于纯培养菌株，以A.cattleyae标准菌株作阳性对照，用非A.cattleyae的植物细菌作阴性 2 GB/T368472018 对照，以双蒸水代替模板作为空白对照，对待测样品进行PCR凝胶电泳检测，具体检测步骤见附录B。 7.3.3实时荧光PCR检测 实时荧光PCR检测具体步骤见附录C，对照设置同7.3.2。 7.4分离培养鉴定 按照7.1的方法制备成组织悬浮液后，用灭菌接种环蘸取悬浮液在金氏B培养基平板上划线分离， 重复3次，28℃恒温培养48h，挑取可疑单菌落进行纯化，转接2次～3次，随后进行致病性测定、 Biolog鉴定、免疫学或分子生物学鉴定。 7.5Biolog鉴定 利用Biolog微生物自动鉴定系统对分离纯化的菌株进行鉴定，按照说明书进行操作及结果判定。 7.6致病性测定 如果有争议或者有必要需按以下步骤对分离纯化的菌株进行致病性测定。将待测菌株在金氏B 培养基上培养48h左右，用无菌水配成10*CFU/mL左右的细菌悬浮液，用针刺法接种至兰花叶片上， 28℃保湿培养，观察是否出现附录A所描述的症状。 8结果评定 依据表1进行检测结果判定。 表 1 免疫学或分子 Biolog鉴定 分离培养鉴定 致病性测定 结果判定 生物学检测 (可选） 任一方法阳性 阳性 阳性 阳性 样品检出兰花褐斑病菌 任一方法阳性 阴性 样品未检出兰花褐斑病菌 一 任一方法阴性 样品未检出兰花褐斑病菌 9 样品及资料保存 9.1样品及菌种保存 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出兰花褐斑病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复 核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。从检测样品中分离并鉴定为兰花褐斑病菌的菌 株，应妥善保存。可采用甘油保存或冻干保存。对不需要长期保存的菌株应及时灭菌处理。 9.2结果记录与资料保存 完整的实验记录应包括：样品来源、种类、时间，检测时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和 审核人员的签学。现场检疫发现的可疑症状、培养基上的菌落特征和人工接种的典型症状等应及时拍 照保存，酶联免疫方法需有酶联反应的原始数据，PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，荧光PCR检 测需有原始数据 3. GB/T36847—2018 附录A （资料性附录） 兰花褐斑病菌相关资料 A.1症状特征 兰花褐斑病菌可为害各个龄期的叶片引起褐斑，严重时可为害至茎秆。症状因寄主品种抗性、发病 条件不同而有差别。主要为害叶片，在高温高湿环境下容易发病，湿度高时有菌浓出现。受感染的叶片 首先出现水渍状斑点，然后逐渐扩大形成不规则坏死斑，周围有黄色晕圈。有的继续扩展形成椭圆形或 长条形水渍状褐斑，病斑周围会出现墨绿色的斑纹，但病斑仍坚硬。病斑通常不扩展到假茎，因此不会 引起死亡。但侵染到生长点，叶茎黄枯，植株很快死亡。田间文心兰的危害率在10%～40%。 兰花褐斑病菌主要为害蝴蝶兰，刚出土至开花成株都容易受害，特别对刚出土的聚合盆，往往整盆 幼苗受害、死亡。病菌感染蝴蝶兰后，典型病征为叶片受感染后首先出现淡褐色水浸状斑点，随后扩大 成为褐、暗褐或黑色的不规则凹陷坏疽斑，周围具明显黄晕，病斑可相互融合成为大斑块；有些感染则会 继续扩展，成为椭圆、长条形或不规则形的深绿色或黑褐色大型水浸状斑，病斑周围通会出现墨绿色环 纹，以手触摸病斑处仍觉坚硬，与软腐病颇不相同，湿度高时如病斑破裂，常可见溢出乳白色的菌泥，罹 病叶片最后黄化干枯，病势如扩展到生长点，则导致整株死亡。幼苗如遭受感后，则迅速软腐而坏死，病 征与软腐病或黑腐病近似。湿度高时或以手触摸水浸状病斑处，会溢出乳白色菌脓。与软腐性病害最 大的不同是罹病叶片之组织仍觉坚硬，病叶亦可保持原姿。症状见图A,1。 A.2寄主范围 主要包括卡特兰属Cattleya、石斛属Dendrobium、米尔顿兰属Miltonia、文心兰属Oncidium、蝶 兰属Phalaenopsis、万带兰属Vanda、香果兰属Vanilla等。 A,3分