ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36845—2018 柑橘顽固病螺原体检疫鉴定方法 Detection and identification of Spiroplasma citri Saglio et al 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36845—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准负责起草单位：中华人民共和国南海出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检 疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国烟台出入境检验检疫局、中华人民共和 国湖南出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：谈珺、李凯兵、刘海军、张京宣、李金庆、周慧平、刘晓红、李贺。 GB/T368452018 柑橘顽固病螺原体检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了进境植物检疫中相橘顽固病螺原体SpiroplasmacitriSaglioetal的检疫鉴定方法 本标准适用于进出境中的葡萄柚、柠檬、橘子、橙和酸性橙等柑橘属植物种果，苗木及昆虫介体等柑 橘顽固病螺原体的检疫鉴定。 2基本信息 2 中文名：柑橘顽固病螺原体 学名:Spiroplasma citri Saglio et al 英文名:Critus stubborn disease,Little leaf disease of citrus,Stubborn disease of citrus 英文缩写：CSD 分类地位：属植物支原体类病原，细菌域（Bacteria），柔壁菌门（Tenericutes），柔膜菌纲（Mollicutes），虫 原体目（Entomoplasmatales），螺原体科（Spiroplasmataceae），螺原体属（Spiroplasma）。 柑橘顽固病螺原体的其他信息参见附录A。 3方法原理 根据柑橘顽固病螺原体的生物学特性、特异性引物PCR扩增及序列测定结果，荧光定量PCR检测 结果确定病原物种类 仪器设备和主要试剂 4 4.1主要仪器设备 普通PCR仪、荧光PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式 小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜 4.2主要试剂和培养基 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。PCR缓冲液、dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、GoTaq DNA聚合酶、引物和探针。 检验中用到的LD8培养基配制方法见附录D。 5检测鉴定方法 5 5.1症状观察 仔细观察柑橘种苗、果实、叶片等，症状描述参见附录A。 1 GB/T368452018 5.2 病原菌的分离培养 柑橘叶条洗净后用75%乙醇表面消毒5min，磨碎后的汁液接种在LD8液体培养基上，30℃培养 12d,显微镜观察病原物收集情况。 5.3 PCR检测 PCR检测时，用从健康的植物组织DNA为阴性对照，用已鉴定的柑橘顽固病螺原体DNA为PCR 扩增的模板做阳性对照，用ddHzO作空白对照 具体操作步骤见附录B。当使用商品化检测试剂盒时，参照试剂盒使用说明进行操作。 5.4序列测定 扩增片段回收后，进行克隆、测序或直接测序，测序可由生物公司完成， 注：序列对比可利用NCBI网站上的BLA.ST软件进行，网址为：http：//wwW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。 5.5 实时荧光PCR检测 实时荧光PCR检测应设置对照，用从健康的植物组织DNA为PCR扩增的模板做阴性对照，用已 鉴定的柑橘顽固病螺原体DNA为PCR扩增的模板做阳性对照，用ddHzO作空白对照 具体操作步骤见附录C。当使用商品化检测试剂盒时，参照试剂盒使用说明进行操作。 6结果判定 当产生以下检测结果时，则判定为检出柑橘顽固病螺原体： 一5.5检测结果为阳性，可判定为检出柑橘顽固病螺原体。 7样品保存与复核 7.1样品、菌株保存 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出柑橘顽固病螺原体的样品应保存于4℃冰箱中，以 备复核。从检测样品中分离并鉴定为柑橘顽固病螺原体的菌株，一80℃长期保存。对不需要长期保存 的菌株应及时高压灭菌处理。 7.2条 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、检测时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人 员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果图片和实时荧光PCR扩增结果图片。 2 GB/T 36845—2018 附录A （资料性附录） 柑桔顽固病螺原体生物学信息 A.1症状特征 该螺原体病害最典型的症状是感病的叶片通常比正常的小，呈丛簇状排列，叶片发生特有的斑驳； 在严重的感染中，有多个芽和过多的节间，以及树的整体发育迟缓，明显矮化；受感染的树木的果实通常 是带有弯曲的柱状的，同一棵树的果实的不规则性，果实比正常小，味道可能是平淡的、酸的或苦的；种 子大部分无繁殖能力，根系较正常小，有的小根呈异常颜色；非季节性开花、不平衡的水果和过早的水果 掉落也是症状之一，早期症状不明显，有时有隐症现象，症状参见图A.1～图A.4。 注：J.M.Bove，INRA(FR)摄 注：J.M.Bove,INRA(FR)摄 图A.1种子发病症状 图A.2果实发病症状 注：J.M.Bove，INRA(FR)摄 注：J.M.Bove,INRA(FR)摄。 图A.3田间植株发病症状 图A.4田间植株发病症状 A.2寄主范围 在自然条件下，只侵染柑橘属（Citrus）。易感病柑橘属的主要经济宿主包括地中海地区的主要商 业物种：葡萄柚（C.parisi）、柠檬（C.limon）、橘子（C.reticulata）、橙（C.sinensis）和酸性橙（C，au rantium),其他寄主是C.grandis，C.limettioides，C.limonia，C.madurensis，C.jambhiri，C.unshiu 和C.paradisixreticulata（Calavan，198o）。柳杉属和种间根茎类杂种（如香茅草）也是侵染对象，在 3 GB/T368452018 A.3分布 美洲：美国、阿根廷、巴西、墨西哥、秘鲁、苏里南、委内瑞拉、 非洲：阿尔及利亚、埃及、利比亚、摩洛哥、索马里、苏丹、突尼斯 亚洲：伊朗、伊拉克、马来西亚、阿曼、巴基斯坦、沙特阿拉伯、叙利亚、也门、阿拉伯联合酋长国。 欧洲：法国、意大利、西班牙、土耳其、塞浦路斯。 大洋洲：新西兰。 A.4形态特征 柑橘顽固病螺原体呈螺旋形，似纺锤型，宽约0.5μm～2um，长约7μm，能动，无细胞壁，由3层单 位膜所包围。分离所得的细胞质膜的微结构和化学成分，与其他类菌原体相似，主要化学成分为：蛋白 质57%、脂质34%、糖类（包括已糖氨)2.2%；相对分子质量为10°的基因组，细胞内含有DNA，RNA、 核糖体颗粒和可溶性蛋白。 A.5发病条件 该病菌生长最适温度为30℃～35℃，生长最适pH值为7.5。病叶磨碎液在固体LD8培养基上培 养12d（32℃），可见产生具特征性的"荷包蛋”状菌落，菌落大小约0.2mm，呈革兰氏阳性。 A.6 传播途径 主要由取食植株韧皮部的介体昆虫传播，如叶蝉（Scaphytopiusnitridus）、甜菜叶蝉（Circulifer tenellus）和Neoaliturushaematoceps等；感病柑橘种苗、接穗等调运可以使柑橘螺原体远距离传播。 柑橘植株之间的嫁接，可以传播柑橘顽固病螺原体，柑橘顽固病螺原体也可通过传播介体侵染其他植 物，如苋科、藜科、十字花科和卷柏属，若将柑橘顽固病螺原体注射于非媒介昆虫体内，只能存活，不具感 染性。 4 GB/T 36845—2018 附录B （规范性附录） PCR凝胶电泳检测 B.1DNA的提取 B.1.1 切下叶片或果实小柱，75%乙醇表面消毒，并用无菌刀片在5mLLD8肉汤培养基中切割，通过 0.45μm过滤器，并在30℃温育。在3d～14d之后，通过用400×至1000×的暗视野显微镜检查 10uL的培养基来检测存在运动的螺旋螺旋体，确认是否存在柑橘顽固病螺原体。 B.1.2取1g待检样品，剪成小段，用液氮研磨成粉末状，移至一灭菌的10mL离心管中，加入10mL 的65℃预热的提取液（100mmol/LTris-HCl，20mmol/LEDTA，50mmol/LNaCl,1.25%SDS 0.1gPVPpH8.0)混匀,65℃水浴20min。 B.1.3 3加人4mL5mol/L的乙酸钾混匀，冰上静置20min。 B.1.44℃，12000g离心10min，取上清液转人一新20mL离心管中；加入1mL5%CTAB，10mL 三氯甲烷剧烈震荡15s，然后在温室下保持2min~15min后，4℃，12000g离心10min。 B.1.5 5将上清液移至一新管，加人0.6倍体积的异丙醇，混匀，12000g离心10min，弃上清液；70%乙 醇洗涤沉淀，室温干燥后，将DNA溶解在100μL灭菌双蒸水中。 其他的DNA提取方法也可以借鉴，也可以选用商业DNA提取试剂盒，提取的DNA在一80℃的 条件下可以冻存1年。 B.2 引物序列 正向引物：5'-GCGGACAAATTAAGTAATAAAAGAGC-3'，反向引物：5'-GCACAGCATTTGC- CAACTACA-3°。本方法的引物扩增区域在基因P58上，GenBank序列号DQ344812，扩增长度