ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T36853—2018 黄瓜细菌性角斑病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Pseudomonas syringae pv. lachrymans 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36853—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国黄岛出人境检验检疫局、中华人民共 和国烟台出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局、中国农业科学院生物技术研究 所、南京农业大学 本标准起草人：田茜、夏明星、赵文军、栗智平、黄迎波、李为民、胡白石、田艳丽。 GB/T36853—2018 黄瓜细菌性角斑病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了黄瓜细菌性角斑病菌的样品制备、分离培养、免疫学及分子生物学等检测方法。 本标准适用于可能携带黄瓜细菌性角斑病菌的黄瓜种子、植株及其产品的检疫鉴定。 2黄瓜细菌性角斑病菌基本信息 中文名：黄瓜细菌性角斑病菌、黄瓜角斑病菌 学名:Pseudomonas syringae pv. lachrymans (Smith &Bryan)Young Dye &Wilkie 1978 异名：Bacillus lachrymans （Smith &Bryan）Holland 1920,Bacterium burgeri （Potebnya) Burgvits 1935,Bacterium lachrymans Smith &Bryan 1915,Chlorobacter lachrymans (Smith&Bry- an) Patel &.Kulkarni 1951,Phytomonas lachrymans (Smith &. Bryan) Bergey et al. 1923,Pseudo- monas burgeri (Potebnya) Korobko &. Nikiforuk 1972,Pseudomonas lachrymans (Smith & Bryan) Carsner 1918,Pseudomonas lachrymans f. cucumis Gorlenko 1961 英文名：Cucurbit angular leaf spot 分类地位：细菌界（Bacteria），变形菌门（Proteobacteria），-变形菌纲（Gammaproteobacteria），假单 胞菌目（Pseudomonadales），假单胞菌科（Pseudomonadaceae），假单胞菌属（Pseudomonas） 传播途径：带菌种子是病原菌远距离传播的主要方式，病原菌由气孔、伤口、水孔侵入寄主，通过灌 溉水、风雨、气流、昆虫及农事操作等在田间传播蔓延。 黄瓜细菌性角斑病菌的其他信息参见附录A。 3方法原理 根据黄瓜细菌性角斑病菌与抗体之间的特异性反应进行免疫学检测；根据黄瓜细菌性角斑病菌的 特异性DNA序列进行分子生物学检测根据黄瓜细菌性角斑病菌的培养性状、生物学特性、寄主范围 及危害症状等对病原菌进行分离培养及致病性测定 仪器设备和主要试剂 4 4.1仪器设备及用具 PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、制冰机、高速冷冻离心机，台式 小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、 SG 4.2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。分子生物学检测所需试剂见附录B和附录C。 营养琼脂（NA)培养基配制方法：牛肉浸膏3.0g，蛋白陈5.0g，酵母膏1.0g，葡萄糖10.0g，琼脂 1 GB/T36853—2018 5田间观察检测 5.1症状观察 对大田及保护地种植黄瓜进行调查，参照附录A中的症状描述观察有无黄瓜细菌性角斑病的症 状，对出现典型症状或可疑症状的植株进行拍照记录，并采集表现症状的植株送实验室进行检测鉴定， 田间无症状植株可随机采样。 5.2 现场检测 采用商品化免疫胶体金试纸条进行现场检测，按照操作说明进行检测及结果判定。 6实验室检测鉴定 6.1样品制备 6.1.1植株样品 对于有症状样品，低倍显微镜下观察病健交界处组织有无溢菌现象，若有溢菌现象，选取新鲜组织 （叶片、茎秆、果实）上的病健交界处（对于无症状样品，随机选取植物组织），在75%乙醇或含有效氯1% 的次氯酸钠溶液中表面消毒50S60S，无菌水清洗3次，然后将其移至灭菌培养血中，加5滴～10滴 无菌水，用灭菌镊子或剪刀将病组织捣碎，静置5min～10min，即制成组织悬浮液，用于分离培养、免 疫学检测及分子生物学检测。 6.1.2种子样品 对于种子样品，随机抽取待检种子300g左右，平均分成3份～5份，用微型粉碎机轻微破碎（至2/ 3以上种子破碎），加人适量pH7.0的0.01mol/L磷酸缓冲液或生理盐水，使种子完全浸没，室温振荡 4h(108r/min），4℃浸泡过夜。将浸泡液1000r/min离心1min，去沉淀，上清液10000r/min离心 10min，弃上清液，取沉淀，用无菌水悬浮，制成1mL～2mL样品悬浮液，用于分离培养、免疫学检测及 分子生物学检测。 6.2免疫学检测 采用商品化ELISA方法进行检测，按照说明书进行操作及结果判定。 6.3分子生物学检测 6.3.1模板制备 对于植株或种子样品，按照6.1的方法制备成样品悬浮液后，直接用商业化植物基因组DNA提取 试剂盒按照操作说明提取样品总DNA，一20℃保存备用。 对于纯培养菌株，可直接或经裂解处理后（97℃沸水浴10min；12000r/min离心10min，取上清 液，一20℃保存）作为分子生物学检测反应模板 根据实验室条件，可选择下列任一方法（6.3.2或6.3.3）进行检测 6.3.2PCR凝胶电泳检测 对于种子、叶片等样品，以已知带菌的黄瓜种子或植物组织作阳性对照（若无已知带菌材料，可用模 2 GB/T36853—2018 拟带菌方式代替），以健康的黄瓜种子或植物组织为阴性对照，以双蒸水代替模板作为空白对照，对待测 样品进行PCR凝胶电泳检测。对于纯培养菌株，以Pseudomonassyringaepv.lachrymans标准菌株 做阳性对照，用非Pseudomonassyringaepv.lachrymans的植物细菌做阴性对照，以双蒸水代替模板 作为空白对照，对待测样品进行PCR凝胶电泳检测，具体检测步骤见附录B。 6.3.3实时荧光PCR检测 实时荧光PCR检测具体步骤见附录C，对照设置同6.3.2。 6.4分离培养鉴定 对于植株样品，按照6.1.1的方法制备成组织悬浮液后，用灭菌接种环蘸取悬浮液在NA培养基平 板上划线分离，重复3次。 对于种子样品，按照6.1.2的方法制备成样品悬浮液后，用无菌水进行10倍梯度稀释3次，各取 离，各重复3次。 将培养皿平板置于26℃恒温培养48h~72h后观察是否有直径1mm1.5mm，白色，有光泽，圆 形，边缘整齐的可疑菌落产生。挑取可疑单菌落进行纯化，转接2次～3次，随后进行致病性测定以及 免疫学或分子生物学鉴定（6.2或6.3）。 6.5致病性测定 使用无菌水将纯培养的菌株配制成10°CFU/mL的细菌悬浮液，采用金刚砂摩擦法接种或刺伤喷 雾法接种在预先培育的4叶期健康黄瓜植株上，每一菌株接种3株～5株，用无菌水接种作对照，接种 后保湿24h，在（24士2）℃，光周期为16h条件下培育，第3天始观察记录发病情况。 7结果判定 7.1植株样品 对于有典型症状植株样品，免疫学或分子生物学检测结果为阳性，即判定为检出黄瓜细菌性角斑病 菌。无症状植株样品，免疫学或分子生物学检测结果阳性，经分离培养及致病性测定为阳性，即判定为 检出黄瓜细菌性角斑病菌。 7.2种子样品 对于种子样品的直接检测，免疫学或分子生物学检测为阳性，初步判定为检出黄瓜细菌性角斑病 菌，若分离培养及致病性测定为阳性，则确定种子样品检出具有活性的黄瓜细菌性角斑病菌。 8样品及资料保存 8.1样品及菌种保存 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出黄瓜细菌性角斑病菌的样品应保存于4℃冰箱中， 以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。从检测样品中分离并鉴定为黄瓜细菌性角 斑病菌的菌株，应妥善保存。可采用甘油保存或冻干保存。对不需要长期保存的菌株应及时灭菌处理。 3 GB/T36853—2018 8.2 结果记录与资料保存 完整的实验记录应包括：样品来源、种类、时间，检测时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和 审核人员的签字。现场检疫发现的可疑症状等应及时拍照保存，PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照 片，实时荧光PCR等需有原始实验数据及相关结果图片 4 GB/T368532018 附录A （资料性附录） 黄瓜细菌性角斑病菌其他信息 A.1症状特征 主要危害叶片、叶柄、卷须和果实，苗期至成株期均可受害。幼苗期子叶染病，开始产生近圆形水浸 状凹陷斑，以后变褐色干枯。成株期叶片上初生针头大小水浸状斑点，病斑扩大受叶脉限制呈多角形， 脆，易穿孔。茎、叶柄及幼瓜条上病斑水浸状，近圆形至椭圆形，后呈淡灰色，病斑常开裂，潮湿时瓜条上 病部溢出菌脓，病斑向瓜条内部扩展，沿维管束的果肉变色，一直延伸到种子，引起