ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36815—2018 蓝莓果腐病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Diaporthe vaccinii Shear 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36815—2018 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草， 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局 本标准主要起草人：罗加凤、崔铁军、刘跃庭、张莹、黄国明、廖芳。 GB/T36815—2018 蓝莓果腐病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了蓝莓果腐病菌的分离培养、致病性测定及分子生物学检测方法 本标准适用于蓝莓果腐病菌寄主种苗、植株和果实中蓝莓果腐病菌的检疫鉴定 蓝莓果腐病菌的基本信息 中文名：蓝莓果腐病菌 学名：DiaporthevacciniiShear 无性学名:Phomopsis vaccinii Shear N.E. Stevens &H.F.Bain 英文名:fruit rot of blueberry,Phomopsis canker of blueberry,upright dieback of cranberry 分类地位：蓝莓果腐病菌（DiaportheacciniShear）属真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascomycota）， 子囊菌纲（Ascomycetes），间座壳目（Diaporthales），间座壳科（Diapouthaceae），间座壳属（Diaporthe）。 传播途径：病菌依靠带菌种苗和果实进行远距离传播 蓝莓果腐病菌的其他信息参见附录A。c 3 方法原理 病原菌的为害症状、分离培养性状、形态特征、致病性测定（参见附录A、附录B、附录C）及ITS1/ ITS4核酸序列比对结果作为蓝莓果腐病菌的检疫鉴定依据。 4仪器用具和主要试剂 4.1仪器用具 4.1.1仪器 体视显微镜、生物显微镜、超净工作台、生物培养箱、电子天平、高压灭菌锅、常规冰箱（一20℃）， PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅。 4.1.2用具 灭菌培养Ⅲ（直径90mm～100mm）、三角瓶、镊子、手术剪、手术刀、接种针、一次性注射器 （1mL）、棉纱、脱脂棉、酒精灯、塑料研杆、可调微量加样器。 4.2主要试剂 氯化镁、蛋白酶K、引物ITS1/ITS4、Taq聚合酶等分子生物学试剂，或用植物组织及真菌基因组提取 试剂盒提取DNA。葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素、乳酸、2.0%次氯酸钠（NaCIO）。 酸性马铃薯葡萄糖培养基（APDA，pH5.0~6.0）、APDA选择性培养基（制备方法参见附录D)。 1 GB/T36815—2018 5病菌的鉴定 5.1症状检查 取待检植株，观察植株枝条是否有萎焉，树皮下是否有溃疡病斑，芽周围的树皮是否变褐色，叶片上 是否有病斑，果实是否有腐烂，枝、叶、果实上是否有病菌的子实体（分生抱子器或子囊壳，参见附录A 中图A.1）。发现子实体的，直接进行镜检；发现有可疑症状但未发现子实体的，取可疑的枝、叶、果实一 5.2直接镜检 的形态特征，同时将孢子转接到APDA选择性培养基上进行分离培养。 5.3保湿培养 可疑枝条病健交界部分，用手术刀切成5cm～7cm长的片段，叶片取整片叶片或切取部分叶片， 果实取整个果实，灭菌水冲洗后进行保湿培养，21℃～24℃，12h/12h光照黑暗交替培养，注意保持湿 度，在体式显微镜下观察是否有分生孢子器等产孢结构形成。分生孢子产生后及时转接到APDA选择 性培养基上进行分离培养。 5.4病原菌的分离培养 未发现病菌子实体的样品进行组织培养，将有可疑症状的枝、叶、果实病健交界处组织剪成1cm～ 2cm长的片段，自来水冲洗后，2.0%次氯酸钠表面消毒1min，再用灭菌水冲洗3次，置APDA选择性 培养基平板上，20℃～24℃培养，培养3d开始观察菌落形态，发现乳白色或白色可疑菌落，立即用 APDA纯化，黑暗培养，7d后体视显微镜下观测分生孢子器产生情况，显微镜下测定分生孢子器、分生 孢子形态特征。 5.5 致病性测定 如有必要，进行致病性测定。 泥炭和沙子按照1：1的比例混匀后，种植蓝莓苗，当蓝莓花芽长出时，用蓝莓果腐病菌孢子悬浮液 （抱子适宜浓度为1X10°CFU/mL）对蓝莓花芽进行喷雾接种，以蒸馏水为对照，接种后放人培养箱内 接种后观察植株发病情况，如出现可疑病斑，取病健交界处组织2.0%次氯酸钠溶液消毒1min，无 菌水清洗3次，置APDA选择性培养基上培养并进行病菌再分离。 5.6核酸序列比对 5.6.1引物 采用ITS1/ITS4进行扩增，目标片段约为590bp。 ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 5.6.2DNA提取 可疑菌株在APDA上生长7d左右，取菌丝提取DNA（参见附录E），也可用植物组织及真菌基因 2 GB/T 36815—2018 组提取试剂盒提取DNA，提取步骤详见使用说明。 5.6.3PCR反应 PCR反应体系总体积30μL，包含：缓冲液3.0μL；10mmol/LdNTP0.5μL；Taq聚合酶2.5U；引 物各0.5μL（20μmol/L)；DNA模板1μL。反应程序：94℃预变性2min；94℃1min，53℃1min， 72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min 单带出现，扩增产物进行序列测定。 将测序获得的序列与NCBI网站GenBank中相关序列进行同源性比对分析。 6鉴定特征 6.1培养性状 APDA培养基上菌落平铺不隆起，乳白色，也有的菌落为黄灰色或灰褐色，产生3个～5个界限明 显的环痕（个别菌株不产生环痕），菌落老熟后环痕不明显，菌丝毡状或羊毛状，菌落生长较快，速度为 10mm/d~12mm/d；培养7d后菌落中出现黑色的分生孢子子座，皮革状，0.8mm~2.8mm，内生分 生孢子器，参见附录B中图B.1。 6.2形态特征 无性态形态特征：分生孢子器黑色，部分埋生于寄主组织或培养基质内，球形至不规则形，基部宽， 天小为（0.5mm~1.0mm）×（1.2mm~1.3mm）分生孢子器常不规则破裂，释放白色、淡黄色或粉红 色成团的分生抱子黏液。分生抱子两种形状α型和β型：α抱子无色，单胞，透明，椭圆形，具2个明显 的油球，大小（6μm~10.5μm）×（2.2μm~3.2μm），平均7.8μm×2.9μm;β孢子线形，钩状，单胞，无 色，大小（15μm~24um）X（1μm1.5μm），平均20μmX1.2μm，参见附录B中图B.2。分生孢子黏 液中α型孢子丰富，β型孢子则较少。 有性态形态特征：有性阶段子囊壳需经过越冬阶段在2年～3年枯死枝条上产生，子囊壳通常在树 皮和木质部之间生成，有时靠近分生孢子器。成熟的子囊壳具长颈，突出树皮外，子囊壳直径（0.3mm～ 0.5mm）×（0.2mm～0.4mm），球形，黑色，壁厚多层，基部较平；子囊椭圆形，无柄，（37μm~51μm）× （7um～12um），孔口小，顶部增厚，含8个子囊孢子；子囊孢子椭圆形，有时不规则形，大小（8um～ 12um）×（2μm～3μm），双胞，隔膜处稍继缩，各具1个油球。培养基上较难产生子囊壳，培养时间 长，子囊和子囊孢子较寄主上小，子囊大小为（32uμm~48um）×（5.8um～9.6μm），子囊孢子为 (6.4 μm~12.8 μm)×(2.5 μm~4.2 μm)。 蓝莓果腐病菌与蓝莓上其他近似种的区别参见附录F。 6.3致病性测定的症状表现 接种后的幼苗在温室生长3d后，接种的花出现坏死，随着花盛开，坏死的情况进一步扩展。接种 后1周，与花芽毗邻的茎出现坏死，在接种2周～3周后病斑继续扩展，茎上坏死溃疡病斑发展成深褐 色（参见附录C中图C.1)。 发病植株茎部病健交界处组织消毒后分离培养，7d后长出6.1及6.2所述典型菌落和分生孢子 器，可证明分离菌是蓝莓果腐病菌的病原菌 3 GB/T36815—2018 6.4 4ITS序列比对 ITS1/ITS4扩增得到大小约为590bp的片断，测序结果与NCBI网站GenBank中Diaporthevac cinii菌株（如：EU571098.1等）序列比对，同源性为99%~100%。 7. 结果判定 病原菌培养性状和形态特征符合6.1及6.2中描述，ITS序列比对结果与6.4描述相符，可鉴定为 蓝莓果腐病菌。 8 样品保存 8.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出蓝莓果腐病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复 核，保存期满后高压灭菌处理。 8.2 2菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为蓝莓果腐病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于PDA培养基斜面 上，存活后置于4℃～8℃黑暗条件下保存，定期（3个月）转接，以防正病菌死亡，至少保存6个月，必要 时用病菌分生孢子制作冻干菌种保存。 8.3 3结果记录与资料保存 实验记录包括样品的来源，种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并有实验人员和审核人员 签字。 4 GB/T36815—2018 附录A （资料性附录） 蓝莓果腐病菌的其他信息 A.1寄主范围 大果蓝莓（Vaccinium macrocarpon）、蔓蓝莓（V.orycocco）、蔓蓝莓中间变种（V.orycoccosvar.