ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36808—2018 木薯细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Xanthomonas cassavae (ex Wiehe et Dowson) Vauterin et al. 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36808—2018 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草， 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 局、中华人民共和国临沂出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：封立平、厉艳、管旭芳、赵丽青、夏明星、伦才智、王简、王英超、吴兴海、邵秀玲。 GB/T368082018 木暑细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了植物检疫中木薯细菌性叶斑病的检疫鉴定方法。 本标准适用于木薯繁殖材料中叶、地上茎、幼苗、树干及树枝中木薯细菌性叶斑病菌检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T28096—2011木薯细菌性萎病菌检疫鉴定方法 3木薯细菌性叶斑病菌的基本信息 3.1名称 学名:Xanthomonas cassavae (ex Wiehe et Dowson)Vauterin et al. 异名:Xanthomonas campestris pv.cassaae(Wiche &Dowson 1953)Maraite &.Weyns 1979 英名：Cassavaleaf spot 3.2分类地位 木薯细菌性叶斑病菌属细菌界Bacteria，变形菌门Proteobacteria，变形菌纲Gammaproteobacteria，黄单 胞菌目Xanthomonadales，黄单胞菌科Xanthomonadaceae，黄单胞菌属Xanthomonas。 4方法原理 木薯细菌性叶斑病菌侵染木薯（Manihotesculenta）。主要通过带病的根茎、叶片等传播，其症状特 点（参见附录A）、培养性状和生物学特性（参见附录A）、致病性测定、病原菌分子生物学特征是该病菌 的鉴定依据。 5 仪器设备 电子天平。 生物显微镜：放大倍数40X～1000×。 5.3 生物安全柜：符合EN12469：2000。 5.4 温控培养箱：温控范围5℃50℃。 5.5 高压灭菌锅：灭菌工作温度105℃~138℃。 5.6 PCR仪：控制精确度士0.25℃，温度范围4℃~99℃。 5.7 琼脂糖水平电泳仪。 5.8 凝胶成像分析系统。 1 GB/T36808—2018 5.9离心机：转速<8000r/min。 5.10超低温冰箱：一80℃。 5.11人工气候箱：控湿范围：相对湿度50%~95%；控温范围：5℃~50℃；光照度：30001x/120001x 220001x两面光照，五级可调。 5.12单道可调微量加样器：适配标准吸嘴2.5μL、20μL、100μL、1000μL。 5.13BIOLOGGENⅢ细菌自动鉴定系统（可选）。 5.14其他：包括解剖刀、量筒、烧杯、培养皿、三角瓶、离心管、枪头、放大镜、手术剪、镊子、试管、接种 环等。 6化学试剂 6.1无水乙醇。 6.2乙二胺四乙酸（EDTA）。 6.3十二烷基硫酸钠（SDS)。 6.4聚乙烯吡咯烷酮。 6.5 5三氯甲烷。 6.6异戊醇。 6.7异丙醇。 6.8 DL2000 DNA Marker. 6.9琼脂糖。 6.101%次氯酸钠溶液：将1mL次氯酸钠加到100mL蒸馏水中。 6.11三烃甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HClpH8.0）：称量121.1gTris置于1L烧杯中，加人约800mL的 去离子水，充分搅拌溶解。加入约42mL的浓盐酸调节pH至8.0。将溶液定容至1L。高温高压灭菌 后，室温保存。 6.1210mg/mL蛋白酶K溶液：将0.1g蛋白酶K溶解于10mL去离子水中。保存在一20℃冰箱 里，避免反复冻融 6.136X上样缓冲液：称量EDTA4.4g、BromophenolBlue250mg、XyleneCyanolFF250mg，共置 于500mL烧杯中。向烧杯中加人约200mL的去离子水后，加热搅拌充分溶解。加人180mL的甘油 后，使用2mol/L氢氧化钠调节pH至7.0。用去离子水定容至500mL后，室温保存。 6.141mol/L氯化镁溶液：溶解20.3g六水氯化镁于足量的水中，定容到100mL。一20℃保存，冰袋 运输。 6.15dNTP（四管套装，含dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种溶液）：一20℃保存，冰袋运输。 6.16TaqDNA聚合酶：一20℃保存，冰袋运输。 6.1710mg/mL溴化乙锭染色液：称量1g的溴化乙锭，加入到100mL容器中。加人去离子水100mL， 充分搅拌数小时完全溶解溴化乙锭。将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。 7实验室检验 7.1症状检查 首先进行木薯病症观察。该病害可造成木薯生长点的损伤；叶片畸形、坏死、调萎、黄化，并产生臭 2 GB/T36808—2018 味；地上茎可发生树皮褪色、溃疡、顶枯、渗液、损伤处附有霉状物、茎内部变色，产生臭味等症状。看重 检查叶片，看是否能发现深绿色的水浸角斑或坏死的角斑。在茎的绿色部位寻找小的损伤或溃疡，看能 否在损伤和溃疡处发现深绿或深褐色的病斑，是否伴有黄色的渗出液。如果在未薯生长的近花期阶段， 可观察植株是否有坏疽或顶梢枯死症状。薯细菌性叶斑病菌在木薯叶片上的侵染症状参见附录A 中图A.1和图A,2,木薯细菌性叶斑病菌与近似种木薯细菌性萎為病菌在症状上的主要区别参见表 A.1。 7.2病菌的分离纯化 7.2.1病组织（病叶或茎段）中病菌的分离 取病健交界处，用1%次氯酸钠溶液处理1min～3min，再用无菌水清洗三次，最后把病组织置放 在洁净的载玻片上捣碎，静置10min～20min，用接种环蘸取汁液在NA平板上划线，划3个平板以上， 28℃下培养3d～5d后，检查并筛选培养基上的菌落。在NA培养基上的菌落为黄色、光滑、奶酪状， 质地黏稠。NA培养基的配制方法见附录B中B.1。 7.2.2菌种纯化 采用平板划线法，即用灭菌的移种环蘸取NA平板上菌落后，在YDCA培养基上进行多次划线纯 化，在28℃下温度下培养3d～5d,移出单个菌落后在YDCA培养基上进一步扩大繁殖。在YDCA培 养基上的菌落也为黄色、光滑、奶酪状，质地黏稠。YDCA培养基的配制方法见B.2。 7.3生化指标测定 采用BIOLOGGENⅢ细菌自动鉴定系统（Version2.8及以上版本）或应用细菌微量生化鉴定管对 可疑菌株进行生化指标的检测。 7.4致病性测定 将在YDCA培养基上培养48h后的菌株，配成10°CFU/mL的细菌悬浮液，采用针刺接种法，用 消毒的接种针蘸上细菌悬浮液，针刺木薯植株的上部幼叶、嫩茎等，每一菌株接种5株，阴性对照用无菌 水代替接种液。接种后的植株置放于人工气候箱，在28℃～32℃温度下，先在100%相对湿度保湿 8h。接种7d后开始观察症状，每天观察一次，接种后30d不表现症状的视为不发病。如接种一周后 观察到植株上的叶片出现黑绿色水渍角斑，直径0.5mm～1mm，病斑扩散较慢的情况，则需进行继续 观察。若2周后出现角斑发展成为坏疽，周围围绕黄色晕环，病斑沿着叶脉扩散并引发整个叶片调萎的 症状视为感病。 7.5PCR检测 从木薯组织（叶片或种茎）中抽提总核酸，进行PCR检测分析。或取分离培养的细菌菌落，制成细 菌悬浮液，进行PCR检测，无需抽提总核酸。检测方法步骤见附录C。 8结果判定 若经症状检验并分离的细菌菌株在培养基上的菌落特征与描述相符，生化鉴定结果与Xanthomonas cassavae特征相符（参见表A,1)，致病性测定表现典型症状，木薯病组织分离物DNA的PCR检测结果 3 GB/T368082018 与附录C的实验结果相符，符合上述所有条件则可以判定为检出木薯细菌性叶斑病菌；否则为未检出。 样品和菌种保存 9 9.1 样品保存 木薯细菌性叶斑病菌的样品至少应保存6个月，以备复检、谈判和仲裁，样品保存期满后，需经灭菌处 理，使用高压灭菌器121℃湿热灭菌20min以上。 9.2 菌种保存 从样品中分离并鉴定为木薯细菌性叶斑病菌的菌株应该转接到NA或YDCA培养基试管斜面 冻干粉，置于一80℃下长期保存 4 GB/T36808—2018 附录A （资料性附录） 木薯细菌性叶斑病菌的相关资料 A.1地理分布 南美洲：哥伦比亚； 非洲：布隆迪、刚果民主共和国、肯尼亚、马拉维、卢旺达、坦桑尼亚、乌干达 A.2寄主植物 木薯（Manihot esculenta)。 A.3症状 木薯细菌性叶斑病的主要症状有叶片角斑、褐变、萎、流脓及根茎部分的溃疡、干枯、褐变、腐烂。 叶片发病初期出现水渍状、暗绿色病斑，病斑常常沿叶脉扩展，合并成多角形的斑块，随着病害的发展， 斑块的中心发生褐变、溢出黄色的菌或由黄晕围绕。初期多是由于冰或风沙造成木薯嫩茎部形成 伤口，病菌由此进入并侵染，2周后在侵染点出现暗绿色的病斑，一个月后病斑可达1cm～2cm，嫩茎 病部黑褐色，下陷，常溢出黄色的菌脓，随后枯萎、落叶。 A.4生物学特性 病原细菌为革兰氏阴性，菌体短杆状，大小0.5μm~0.6μm×1.5μm~1.8μm，多数以10