ICS 07.080 C 27 中华人民共和国国家标准 GB/T 36389—2018 T4 DNA 连接酶 T4 DNA ligase 2019-01-01实施 2018-06-07发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T36389—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国工具酶标准化工作组（SAC/SWG11)归口。 本标准起草单位：福建南生科技有限公司、福建华灿制药有限公司、苏州海狸生物医学工程有限公 司、厦门致善生物科技股份有限公司、厦门大学、安琪酵母股份有限公司。 本标准主要起草人：郑登忠、詹学雄、黄发灿、任辉、赵晶、章丽丽、宋娜杰、张永有、姚鹃。 GB/T36389—2018 引 键结合的反应，促使黏性末端之间或平末端之间的连接。制订T4DNA连接酶国家标准，用以推动该 类工具酶的产业化具有重要的意义。 Ⅱ GB/T36389—2018 T4DNA连接酶 1范围 本标准规定了T4DNA连接酶的技术要求、检验方法、包装、运输、贮存和保质期。 本标准适用于从重组基因工程菌分离纯化的T4DNA连接酶。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T191 包装储运图示标志 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 YY/T0087 电泳装置 YY/T 0657 医用离心机 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 T4DNA连接酶T4DNAligase -种核酸连接酶，能催化相邻DNA链的5°-P末端和3'-OH末端以磷酸二酯键结合的反应，促使 黏性未端之间或平末端之间的连接 3.2 T4 DNA连接酶活性单位 activity unit of T4 DNA ligase 的入DNA片段[5端浓度为0.12μmol/L(300μg/mL)]连接所需的酶量定义为1个活性单位（U)。 4 技术要求 4.1 外观 澄清透明的液体，无沉淀。 4.2 T4DNA连接酶活力 ≥8 000 U/mL 4.3杂质 不应含有核酸外切酶和核酸内切酶。 1 GB/T36389—2018 检验方法 5.1 1外观 直接或将样品倒入无色透明试管中，在自然光条件下，肉眼观察。 5.2 2T4DNA连接酶活力 依据附录A的方法进行检测。 5.3 3杂质 5.3.1 核酸外切酶 依据附录B的方法进行检测。 5.3.2 核酸内切酶 依据附录C的方法进行检测。 包装、运输及贮存 6.1 包装 内包装材料应洁净无污染，封口应严密，无泄漏。外包装箱储运图示标志应符合GB/T191的 规定。 6.2 2运输 产品应在冷冻条件下运输，运输工具应清洁卫生、干燥，并有防雨、防晒设施，运输过程中应做好防 护措施避免倒置及破损。不宜与有毒、有害、有异味物品混运。 6.3 贮存 应在温度低于一20℃的条件下储存。 保质期 5ZG 在符合本标准规定的条件下，包装完好未启封的产品保质期为3年；超过保质期，使用前应检测酶 活力。 2 GB/T36389—2018 附录A （规范性附录） T4 DNA连接酶酶活力检测 A.1 仪器设备 A.1.1 紫外分光光度计。 A.1.2 电泳系统，应符合YY/T0087的要求。 A.1.3 冷冻离心机：可以在4℃下进行离心，离心转速10000r/min以上，应符合YY/T0657的要求。 A.2 试剂 A.2.1总则 除非另有规定，本方法所用的试剂应为不含DNA和DNase的分析纯试剂，所有试剂溶液宜大体积 配制、小体积分装后经高压灭菌后使用，不宜高压灭菌的试剂应用0.22μm过滤器过滤除菌；酶缓冲液 应避免反复冻融；水为GB/T6682规定的一级水。 A.2.2 溶剂配制 A.2.2.1TE缓冲液:10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),使用HCl或 NaOH调节 pH。 A.2.2.210×T4DNA连接酶缓冲液:400 mmol/LTris-HCl,100 mmol/LMgCl2,100 mmol/L二硫 苏糖醇(DTT),5 mmol/LATP(pH7.8)。 A.2.2.350XTAE缓冲液：称取484gTris，量取114.2mL冰乙酸,200mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)， 溶于水中，定容至2L。 A.2.2.410×凝胶加样缓冲液：含0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油水（体积分数）溶液。 A.3 试验步骤 A.3.1 ΛDNA-HindⅡ底物制备 A.3.1.1按表A.1配制酶切反应体系 表A.1酶切反应体系 试剂 体积V/μL 10× Buffer 40 DNA(0.3 μg/μL) 60 Hind II (20 U/μL) 10 水 290 总体积 400 注：加酶之前将反应混合物混匀（可以用移液枪吸取混匀吸取混合或轻弹管壁，切忌振荡混匀）；轻轻混匀，短暂 离心。 3 GB/T36389—2018 A.3.1.237℃反应4h。反应结束后向样品管中加人等体积的酚-氯仿-异戊醇（25十24十1），轻轻摇 匀；12o00r/min离心8min。小心地将上清转移到新的微量离心管中，不要吸到下面有机相里的液体 A.3.1.3加入等体积的氯仿-异戊醇（24十1），轻轻摇匀；12000r/min离心8min。小心地将上清转移 到新EP管中。 A.3.1.4加人1/10体积的3mol/L醋酸钠颠倒混匀，再加2倍以上体积的无水乙醇，颠倒充分混匀后 室温放置沉淀。 A.3.1.5用适量75%~80%乙醇清洗白色沉淀2次。 A.3.1.6放于超净台轻风将残余乙醇吹干，也可以室温蒸发。 A.3.1.7 用适量的TE缓冲液溶解DNA。 A.3.1.8紫外分光光度计和琼脂糖电泳检测DNA浓度和纯度（电泳检测结果条带清晰明亮，无杂带， 范围分布在23130bp~125bp之间。紫外可见分光光度计测定产物的A260/A280在1.8~1.9之间， A260/A230>2)。 A.3.2 T4DNA连接酶活力检测 按表A.2顺序配制20μL连接反应体系，每个梯度设置3个平行。 表A.2酶活力测定反应体系 试剂 加人量 10XT4DNAligase缓冲液 2 μL 底物DNA（一般用入DNA-HindⅢ片段 1 μg 参照酶/待测酶 分别加入0.0μ,0.5μ,1.0μ,1.5μL,2.0μ 水 补齐至20μl 注1：待测酶用贮存溶液稀释至约1U/μL；参照酶根据标示量用贮存溶液精确稀释至1U/μL（1weiss=200U）。 注2：本标准暂采用NEBT4DNA酶为参照酶，待有市售T4DNA连接酶标准物质时，可直接替换采用标准物质 作对照。 注3：构建连接酶的阳性对照组和无酶阴性对照组。 注4：加酶之前将反应混合物混匀（可以用移液枪吸到混匀或轻弹管壁，切忌振荡混勾）；轻轻混匀，短暂快速离 心，在最适温度下（一般为16℃），反应30min。 A.3.3电泳 称取0.8g琼脂糖，于100mLTE缓冲液中加热，充分溶解，加人溴化乙锭（10mg/mL）稀释至终 浓度为0.5μg/mL，制胶。在电泳槽中加入TE缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5μL8μL酶连接 部。紫外检测仪下观察电泳结果并记录。 A.4酶活力计算 A.4.1观察电泳结果，取待测酶和参照酶电泳图谱条带最一致的进行比较计算。 A.4.2酶活力计算[见式（A.1)]： 4