65.020.20 CCS B 22 ICS DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB 32/ T 4056—2021 优良食味半糯粳稻品质 Quality of semi-glutinous japonica rice with good taste 2021 - 06 - 03 发布 江苏省市场监督管理局 2021 - 07 - 03 实施 发 布 DB32/ T 4056-2021 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由江苏省农业科学院提出。 本文件由江苏省农作物标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：江苏省农业科学院、扬州大学、江南大学、江苏里下河地区农业科学研究所、江 苏省种子管理站、江苏省农业技术推广总站。 本文件主要起草人：王才林、张亚东、张洪程、刘巧泉、王莉、李爱宏、何金龙、管永祥、朱镇、 宋锦花、魏海燕、赵春芳、魏晓东、陈涛、赵庆勇、赵凌、姚姝、周丽慧、路凯、梁文化。 I DB32/ T 4056-2021 优良食味半糯粳稻品质 1 范围 本文件规定了优良食味半糯粳稻品质的术语和定义、质量要求、检验方法、检验规则及判定规则。 本文件适用于半糯粳稻品种的选育、鉴定、评价和推广，适用于商品半糯粳稻的收购、加工和销售。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 1350 稻谷 GB/T 1354 大米 GB/T 5490 粮食检验 一般规则 GB/T 5491 粮食、油料检验 扦样、分样法 GB/T 15682 粮油检验 稻谷、大米蒸煮食用品质感官评价方法 GB/T 17891—2017 优质稻谷 GB/T 21719 稻谷整精米率检验法 GB/T 22294 粮油检验 大米胶稠度的测定 NY/T 83 米质测定方法 NY/T 593 食用稻品种品质 NY/T 2639 稻米直链淀粉的测定 分光光度法 3 术语和定义 GB 1350、GB/T 1354、GB/T 17891 和 NY/T 593 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 半糯粳稻 semi-glutinous japonica rice 稻米直链淀粉含量在 2%~13%之间，含有低直链淀粉含量的 Wx 等位基因（如 Wxmp、Wxmq、Wxmw 等）的粳稻。 3.2 优良食味半糯粳稻 semi-glutinous japonica rice with good taste 品质达到本标准 4 规定的质量要求、品质等级三级及以上的半糯粳稻。 1 DB32/ T 4056-2021 3.3 鉴别标记 identification molecular marker 用于鉴别低直链淀粉含量基因（如 Wxmp、Wxmq、Wxmw 等）、经 PCR 反应扩增出的特征性条带或 序列，详见附录 A。 4 质量要求 4.1 基本质量要求 杂质含量、水分含量、黄粒米含量、谷外糙米含量、色泽气味等基本质量指标应符合 GB 1350 粳 稻谷要求，不完善粒含量应≤3%，异品种率应≤2%。 4.2 定等质量指标 在符合 GB 1350 的基础上，优良食味半糯粳稻的定等质量指标见表 1。 表 1 优良食味半糯粳稻品质等级 等级 指标 一 二 三 整精米率/% ≥ 67.0 61.0 55.0 透明度/级 ≤ 1 2 3 直链淀粉（干基）含量/% 8.0~13.0 胶稠度/mm ≥ 90 80 70 食味值/分 ≥ 90 85 80 注 1：等级评定须在相同的水分条件下进行。 5 检验方法 5.1 低直链淀粉含量基因 Wxmp、Wxmq、Wxmw 的检验按照附录 A 执行。 5.2 不完善粒含量检验：按GB/T 17891—2017，6.5执行。 5.3 异品种率检验：按照GB/T 17891—2017，附录B执行。 5.4 整精米率检验：按照GB/T 21719执行。 5.5 透明度检验：按照 NY /T 83 执行。 5.6 直链淀粉（干基）含量检验：按照 NY/T 2639 执行。 5.7 胶稠度检验：按照 GB/T 22294 执行。 5.8 食味值检验：按照 GB/T 15682 执行。 2 DB32/ T 4056-2021 6 检验规则 6.1 扦样、分样按照 GB /T 5491 执行。 6.2 检验的一般规则按照 GB /T 5490 执行。 7 判定规则 7.1 类型判定 含有低直链淀粉含量基因（如 Wxmp、Wxmq、Wxmw 等）的，判定为半糯粳稻。 7.2 等级判定 达到本标准 4.1 规定的基本质量要求，表 1 中 5 项定级指标全部达到该等级要求的，则判定为该等 级半糯粳稻。5 项定级指标中有 1 项达不到该等级质量要求的，逐级降至符合的等级；不符合最低等级 指标要求的，为非等级产品。基本质量要求有 1 项及以上不符合的，为非等级产品。 7.3 等级分类 品质等级达三级及以上的判定为优良食味半糯粳稻，低于三级的判定为普通半糯粳稻。 3 DB32/ T 4056-2021 附 录 A （规范性） mp mq mw 低直链淀粉含量基因Wx 、Wx 和Wx 分子标记检测方法 A.1 原理 低直链淀粉含量突变基因Wxmp、Wxmq和Wxmw是在Wxb基因的第4、第5和第6外显子发生了单碱基突 变（图A.1）。仅在第4外显子第53位碱基发生G-A突变的为Wxmp基因，同时在第4外显子第53位碱基发 生G-A突变和第5外显子第52位碱基发生T-C突变的为Wxmq基因，仅在第6外显子第62位碱基发生A/C突 变的为Wxmw基因。利用四引物扩增受阻突变体系PCR技术可针对第4和第6外显子的变异位点进行分子 标记检测；利用成对引物可针对第5外显子的变异位点进行PCR扩增和序列分析，根据突变位点的有无 和类型，来判断是否含有突变基因Wxmp、Wxmq和Wxmw。 mp mq mp 图A.1 Wx基因的结构及Wx 、Wx 和Wx 基因突变位点示意图 A.2 仪器设备 高速冷冻离心机、PCR扩增仪、超纯水系统、组织研磨仪、琼脂糖凝胶电泳系统及制胶附件、凝胶 成像系统、微量可调移液器（2 uL、10 uL、100 uL、1000 uL）。 A.3 试剂与溶液 A.3.1 DNA提取试剂 十六烷基三甲基溴化铵、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、盐 酸、氢氧化钠、氯化钠。 A.3.2 PCR扩增试剂 DNA、引物、dNTP、Taq酶、10×PCR缓冲液、超纯水。 A.3.3 电泳试剂 1 DB32/ T 4056-2021 6×上样缓冲液、DNA分子量标准、1×TAE电泳缓冲液、核酸染料。 A.3.4 DNA回收试剂 凝胶回收试剂盒。 A.4 DNA 提取 稻谷出苗后在三叶期按单株取水稻叶片，提取基因组 DNA。DNA 提取方法及试剂配制方法按 NT/T 1433 执行。 A.5 分子标记序列 A.5.1 用于鉴定Wxmq或Wxmp的分子标记序列 利用四引物扩增受阻突变体系 PCR 技术可对 Wxmq 或 Wxmp 第 4 外显子第 53 位碱基发生的 G-A 突 变进行分子标记鉴定，四引物序列为： 正向外引物（Wxmq/Wxmp-O-F）序列为 5'-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTGCAGGC-3'， 反向外引物（Wxmq/Wxmp-O-R）序列为 5'-GTAGATCTTCTCACCGGTCTTTCCCCAA-3'， 正向内引物（Wxmq/Wxmp-I-F）序列为 5'-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3'， 反向内引物（Wxmq/Wxmp-I-R）序列为 5'-GTCGATGAACACACGGTCGACTCAAT-3'。 利用成对引物 PCR 扩增法可对 Wxmq 第 5 外显子第 52 位碱基发生的 T-C 突变进行分子标记鉴定， 成对引物序列为： 正向引物（Wxmq-F）序列为 5'-GGCTTCACGCAACGGCGCTACAAATAG-3'， 反向引物（Wxmq-R）序列为 5'-CCATTCGCCTGCAAAGAACACAAGAAC-3'。 A.5.2 用于鉴定Wxmw的分子标记序列 利用四引物扩增受阻突变体系 PCR 技术可对 Wxmw 第 6 外显子第 62 位碱基发生的 A/C 突变进行分 子标记鉴定，四引物序列为： 正向外引物（Wxmw-O-F）序列为 5'- GCTTAGCTTCCACTGGTGATTTCA-3'， 反向外引物（Wxmw-O-R）序列为 5'- GTAGATGCCATTGGGCTGGTAGT-3'， 正向内引物（Wxmw-I-F）序列为 5'- AACAACCCATACTTCAAAGGAACATC-3'， 反向内引物（Wxmw-I-R）序列为 5'- TCTTGAGATCAATTGTAACTCCCCAT-3'。 A.6 PCR 反应体系 20 μL PCR 反应体系，包括 2.0 μL 样品 DNA (10 ng/μL)，2.0 μL 引物等摩尔混合液(4 pmol/μL/每条)， 2.0 μL 10×PCR 缓冲液 (含 MgCl2)，0.4 μL dNTP (2.5 mmol/L)，0.5 μL Taq 酶(5U/μL)，13.1 μL 超纯水。 2 DB32/ T 4056-2021 A.7 PCR 反应程序 A.7.1 Wxmq 或 Wxmp 第 4 外显子分子标记的 PCR 反应程序 95℃下预变性 3 min；95℃下变性 30 s，65℃退火 30 s，72℃下延伸 1 min，共 33 个循环；72℃延 伸 5 min，4℃保存。反应在 PCR 扩增仪（热循环仪）上进行。 A.7.2 Wxmq 第 5 外显子分子标记的 PCR 反应程序 95℃下预变性 3 min；95℃下变性 30 s，58℃退火 30 s，72℃下延伸 2 min，共 33 个循环；72℃延 伸 5 min，4℃保存。反应在 PCR 扩增仪（热循环仪）上进行。 A.7.3 Wxmw 分子标记的 PCR 反应程序 95℃下预变性 3 min；95℃下变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃下延伸 1 min，共 33 个循环；72℃延 伸 5 min，4℃保存。反应在 PCR 扩增仪（热循环仪）上进行。 A.8 PCR 产物检测 A.8.1 琼脂糖凝胶制备 在三角