ICS 65.020.01 B 30 DB 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1626—2019 灵芝菌种生产技术规程 Regulation of Strain Manufacture for Mythic Fungus 2019-04-10 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2019-07-10 实施 发 布 DB15/T 1626—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则编写。 本标准由内蒙古自治区农牧业科学院提出。 本标准由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC 20）归口。 本标准起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、食用菌内蒙古自治区工程研究中心。 本标准主要起草人：李亚娇、孙国琴、王海燕、庞杰、于传宗、高天云、潘永圣、云利俊、郭俊波、 宋秀敏、李国银、陈友君。 I DB15/T 1626—2019 灵芝菌种生产技术规程 1 范围 本标准规定了制作灵芝（Ganoderma lucidum）母种、原种和栽培种有关的定义、制作技术流程要 点等。 本标准适用于工厂化生产企业或专业合作社生产灵芝母种、原种和栽培种。 2 规范性引用文件 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 灵芝 Ganoderma lucidum 灵芝（Ganoderma lucidum），别名瑞芝、仙草，俗称“灵芝草”，隶属于担子菌纲（Basidiomycetes）、 多孔菌目（Polyporales）、灵芝科（Ganodermataceae）、灵芝属（Ganoderma）。 2.2 菌种 spawn 菌丝体生长在适宜基质上具结实性的菌丝培养物。分为母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种 （三级种）三级。 2.3 母种 stock culture 经组织分离、孢子分离等方式获得到的具有结实性的菌丝体纯培养物及其继代培养物，以玻璃试管 或培养皿为培养容器和使用单位，也称为一级种、试管种。 2.4 原种 pre-culture spawn 由母种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物，也称为二级种。 2.5 栽培种 spawn 由原种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物，也称为三级种。栽培种只能用于扩大到栽培出菇袋 或直接出菇，不可以再次扩大繁殖菌种。 1 DB15/T 1626—2019 2.6 固体菌种 solid spawn 以富含木质素、纤维素和半纤维素或淀粉含量高的谷物粒等天然有机物为主要原料，添加适量的有 机氮源和无机盐类，具一定水分含量的培养基培养的纯菌丝体。是传统食用菌生产使用菌种状态，也用 于菌种保存。 2.7 液体菌种 liquid spawn 培养基营养成份与母种相同、不加琼脂的液体培养基，通过摇瓶震荡培养或深层发酵技术快速获得 的大量的纯双核菌丝体，菌丝体在液体培养基中呈絮状或球状。液体菌种可以作为原种或栽培种直接接 种在固体培养袋中，不能进行菌种保存。 3 菌种生产要求 3.1 人员 菌种生产所需要经过专业培训、掌握滑子菇基础知识及灵芝菌种生产技术规程要求的技术人员和检 验人员。 3.2 环境 应选择地势高，通风良好，空气清新，水源近，排水通畅，交通便利的场所。 300m之内无酿造厂、集贸市场、规模养殖的畜禽舍、垃圾和粪便堆积场，无污水、废气、废渣、烟 尘和粉尘等污染源。 3.3 设施 厂房要求有各自隔离的摊晒场、原材料库、配料分装库。配套有配料室、搅拌室、装袋（瓶）室、 灭菌室、冷却室、接种室、培养室（通风好，有纱窗）、菌种检测室及菌种冷藏库等各环节的设施。冷 却室、接种室，培养室都要有离子净化设施。 3.4 设备 生产需要粉碎机、电子秤、搅拌机、装袋（瓶）机、高压灭菌锅或常压灭菌锅、离子净化器、超净 工作台或接种箱、恒温培养箱、培养架、摇床、液体菌种灌（30L～250L）、显微镜等设备。 3.5 容器 3.5.1 母种生产容器 试管选用18mm×180mm或者20mm×200mm；培养皿选用直径7cm～9cm玻璃培养皿或一次性塑料培养皿。 3.5.2 原种、栽培种生产容器 3.5.2.1 固体菌种 2 DB15/T 1626—2019 原种采用850ml以下、瓶口直径≤4cm、耐126℃高温的透明瓶子，或采用（12～17）cm×（22～28） cm的聚丙烯塑料袋。 栽培种采用同原种要求相同的瓶子，也可采用（15～17）cm×（33～35）cm的聚丙烯塑料袋。 3.5.2.2 液体菌种 三角瓶液体菌种容器：采用150ml～500ml三角瓶，带滤膜的封口膜。 液体菌种罐：采用专业厂家生产的液体菌种罐。 3.6 培养原料 硫酸镁、磷酸二氢钾、蛋白胨、蔗糖、葡糖糖、石膏、琼脂粉等均采用分析纯。 马铃薯、麦粒、谷粒、玉米粒、柠条粉、棉籽壳、木屑、玉米芯粉、豆秸粉要求无霉变。 4 母种生产 4.1 生产流程 见示例图。 图1 菌种生产流程示例图 4.2 培养基 以下培养基任选其一： ——PDA 改良培养基。  豆饼粉 20g 加水 1200ml 煮沸 15min，滤液定容至 1000ml，加入蛋白胨 1g、酵母粉 1g、硫 酸镁 0.5g、磷酸二氢钾 1g、葡萄糖 10g、蔗糖 10g、琼脂粉 8g～10g，pH 自然；  新鲜无病去皮马铃薯 200g 切片加水 1200ml 煮沸 15min，滤液定容至 1000ml，加入蛋白胨 1.6g、酵母粉 1.6g、硫酸镁 0.5g、磷酸二氢钾）1g、葡萄糖 10g、蔗糖 10g、琼脂粉 8g～ 10g， pH 自然；  麦粒 100g 加水 1200ml 煮沸 15min，滤液定容至 1000ml，加入蛋白胨 1.5g、酵母粉 1.5g、 硫酸镁 0.5g、磷酸二氢钾 1g、葡萄糖 10g、蔗糖 10g、琼脂粉 8g～10g，pH 自然；  新鲜无病去皮红薯 200g 切片加水 1200ml 煮沸 20min，滤液定容至 1000ml，加入蛋白胨 1.6g、酵母粉 1.6g、加入硫酸镁 0.5g、磷酸二氢钾 1g、葡萄糖 10g、蔗糖 10g、琼脂粉 18g～10g，pH 自然； ——PDA 培养基。新鲜无病去皮马铃薯 200g 切片加水 1200ml 煮沸 20min，滤液定容至 1000ml，加 入硫酸镁 0.5g、磷酸二氢钾 1g、蔗糖 20g、琼脂粉 8g～10g，pH 自然。 4.3 分装和灭菌 3 DB15/T 1626—2019 母种培养基温度降到90℃即可分装至不同容器。 4.3.1 试管母种制作 4.3.1.1 分装 分装培养基至试管1/4处，用棉塞或硅胶塞封闭试管口，每5支试管为1把，牛皮纸包棉塞，橡皮筋 扎紧，棉塞向上放置。棉塞应采用梳棉，不能使用脱脂棉。 4.3.1.2 灭菌 121℃～124℃（0.11MPa～0.14MPa）保持25min。 4.3.1.3 冷却 灭菌完毕后自然降压，降温至（65±5）℃左右时取出试管，在空气清洁的室内摆斜面，斜面长度 不超过试管长度的2/3，自然降温凝固后成斜面。 4.3.2 培养皿母种制作 4.3.2.1 灭菌 培养基装入300ml～500ml三角瓶至刻度的2/3处，用带滤膜的封口膜封口后灭菌。培养皿用报纸包 好，同时放入灭菌锅灭菌。在121℃～124℃（0.11MPa～0.14MPa）保持25min。 4.3.2.2 分装 灭菌完毕后自然降压，降温至70℃±5℃时取出三角瓶和培养皿放入无菌超净工作台或接种箱内， 将三角瓶内培养基摇匀后快速均匀倒入无菌培养皿中，培养基占培养皿高度的1/3～1/2。迅速盖好上盖。 自然降温凝固后制成平板培养基。 4.4 检测 抽取3%～5%的试管和培养皿，在28℃下培养48h，无微生物长出为灭菌合格。 4.5 接种 在超净工作台或接种箱内接种，接种前用紫外灭菌灯照射30min后打开风机20min，之后用75%酒精 进行表面消毒。 接种的菌块3mm～5mm，接种在培养皿或试管的中部。培养皿需用石腊封口膜密封。 接菌过程严格执行无菌操作，接种后及时贴好标签并做好记录。 4.6 培养 温度控制在23℃～26℃，空气湿度在75%以下，通风避光培养。 4.7 母种检查 母种接种后第3天、第7天和菌丝体长满培养基后分别逐个进行检验，挑出未活、污染和生长不良的 不合格培养物，拿到准备室及时进行淘汰处理。 表1 灵芝母种感官要求 4 DB15/T 1626—2019 项目 要求 容器 棉塞或无棉盖体 完整、无损、洁净 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和过滤要求 培养基灌入量 为试管总容积的1/4，培养皿高的1/3～1/2 菌 种 外 观 菌丝生长量 长满斜面或平板 菌丝体特征 菌丝体表面 菌丝洁白、绒毛状、生长致密、均匀、健壮 均匀、舒展、平整 菌丝体分泌物 菌落边缘 无 整齐 杂菌菌落 斜面背面外观 无 培养基不干缩，无积水、颜色均匀、无暗斑、无色素 5 原种、栽培种生产 5.1 固体菌种 5.1.1 培养基 ——粮食培养基。谷粒、麦粒或玉米粒 90%，柠条粉或棉籽壳、木屑、玉米芯粉、豆秸粉 9%，石 膏 1% ，石灰 1%，水分含量（60～65）%，调节 pH 至 7.0～7.5。 ——组合培养基：  玉米芯 39%+木屑 39%+麸皮 20%+石膏 1%+石灰 1%、水分含量（60～65）%调节 pH 至 7.0～ 7.5；  棉籽壳 80%+麦麸 18%+石膏 1%+石灰 1%、水分含量（60～65）%调节 pH 至 7.0～7.5；  B.3 木屑 78%+麦麸 17%+豆饼粉 3%+石膏 1%+石灰 1%、水分含量（60～65）%调节 pH 至 7.0～ 7.5；  B.4 柠条粉 78%+麦麸 17%+玉米粉 3%+石膏 1%+石灰 1%、水分含量（60～65）%调节 pH 至 7.0～7.5；  B.5 豆秸粉 78%+麦麸 17%+玉米粉 3%+石膏 1%+石灰 1%、水分含量（60～65）%调节 pH 至 7.0～7.5。 5.1.2 装袋（瓶） 培养基的多种组成按照比例称量干料搅拌均匀，边加水边混拌均匀，含水量60±2%。 采用装袋（瓶）机或人工进行装袋（瓶），人工装袋（瓶）需用打孔器在袋口处打孔，孔直径1cm～ 1.5cm深度为8cm～12cm，无棉盖体或海绵封口。 5.1.3 灭菌 培养基质装袋（瓶）后要求在3h之内使菌种袋表面温度达到100℃。灭菌可分为高压灭菌和常压灭 菌。 常压灭菌：保持100℃ 8～9h。 高压灭菌：组合培养基维持121℃～123℃（0.11MPa～0.13 MPa）2h；粮食培养基维持121℃～123℃ （0.11MPa～0.13MPa）2.5h。 5.1.4 接种 5 DB15/T