ICS 65.020.20 B 31 DB44 广 东 省 地 方 标 准 DB44/T 2207—2019 辣椒品种抗辣椒脉斑驳病毒鉴定技术规程 The regulation for resistance evaluation of pepper to chilli veinal mottle virus 2019 - 10 - 31 发布 广东省市场监督管理局 2020 - 01 - 31 实施 发 布 DB44/T 2207—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准附录A为规范性附录，附录B、C、D为资料性附录。 本标准由广东省农业农村厅提出并归口。 本标准主要起草单位：广东省农业科学院植物保护研究所、湖南省植物保护研究所。 本标准主要起草人：何自福、汤亚飞、佘小漫、刘勇、蓝国兵、邓铭光、于琳、李正刚。 I DB44/T 2207—2019 辣椒品种抗辣椒脉斑驳病毒鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了辣椒品种抗辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）鉴定技术的术语与 定义、毒原准备、室内抗性鉴定、病情调查、抗性评价和鉴定报告撰写。 本标准适用于辣椒 （Capsicum annuum L.） 品种及材料对辣椒脉斑驳病毒的抗性室内鉴定及评价。 2 术语与定义 下列术语和定义适合于本标准。 2.1 辣椒脉斑驳病毒 Chilli veinal mottle virus，ChiVMV 辣椒脉斑驳病毒为马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯 Y病毒属（Potyvirus）成员，具有马铃薯 Y病毒属成员基因组结构的典型特征，主要依靠蚜虫以非持久方式传播，也可以通过病株汁液和机械接 触等方式传播，但不能通过种子传播，其自然寄主主要是辣椒、番茄等茄科作物。辣椒受到ChiVMV侵染 后，主要表现为叶脉呈现暗绿条纹，叶缘皱缩，叶片畸形、变小，幼嫩叶片症状更为明显；早期感染会 抑制植株生长，主茎和分枝上呈现暗绿条纹；最终导致落花、落果，果实畸形等。 2.2 毒原 virus source 毒原ChiVMV-GD：采自广东辣椒主产区的典型病样，经检测、纯化、鉴定、扩繁后，保存的用于后 续实验的样品。 2.3 人工机械摩擦接种 artificial mechanical inoculation 通过人工操作，在供试植物叶面上造成微小伤口，使病毒从伤口进入细胞内而引起发病的过程。 2.4 抗病性鉴定 identification of disease resistance 采用合适的技术方法，鉴定作物对特定病害的抗性水平。 3 毒原 ChiVMV-GD 准备 从广东辣椒主产区采集表现皱缩、花叶、斑驳、褪绿等症状的病叶，经分子检测确定病样中存在 ChiVMV，然后通过人工机械摩擦接种到能产生枯斑的健康三生烟（Nicotianan tabacum. cv. Samsum） 叶片上；对病样进行分离与纯化，经RT-PCR检测，测序 确定无误后，将纯化的ChiVMV接种到健康辣椒植 1 DB44/T 2207—2019 株上繁殖，待已接种辣椒新叶显症后，再进行RT-PCR检测，确定无误后，采集辣椒病叶，放置-80℃保 存备用。具体见附录A。 4 仪器设备 电子天平，恒温培养箱，研钵，超低温冰箱，量筒，普通冰箱，PCR仪，电泳仪，凝胶成像系统， 移液器，离心机，恒温水浴锅。 5 室内抗性鉴定 5.1 接种室 室内抗性鉴定应具备良好的发病环境的60目防虫日光温室中进行。 5.2 育苗 待测辣椒种子经10%磷酸三钠溶液（见附录D）中浸泡20 min，清水冲洗后放置在28℃恒温培养箱催 芽至露白，然后直播于8 cm×12 cm黑色塑料育苗杯中，每杯2粒。播种用基质土为经121℃湿热灭菌消 毒30 min的新鲜育苗基质土。育苗在60目防虫日光温室进行，室内温度应控制在25℃～30℃，确保幼苗 生长健壮、长势一致。 5.3 鉴定品种设置 鉴定品种随机排列设置，4次重复，每个处理30株。 5.4 接种 5.4.1 接种时间 在辣椒3片～4片真叶期进行接种。 5.4.2 接种病原制备 1 g新鲜病叶或-80℃保存的病原病毒感病的发病叶组织加10 mL磷酸缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.2， 见附录D），在灭菌的研钵中匀浆，再经灭菌纱布过滤，其滤液为接种悬浮液。 5.4.3 接种方法 在叶面上撒少量400目～600目金刚砂，然后用棉签蘸取接种悬浮液在叶片上顺叶脉方向轻轻摩擦， 再用清水将叶面多余的悬浮液和金刚砂轻轻洗去，每株接种上部2片真叶。 5.4.4 接种后的管理 供试幼苗置于接种室内继续培养，保持接种室温度为25℃～30℃，自然光照，常规水肥管理。 6 病情调查 6.1 调查时间 接种后15 d～30 d进行，每隔15 d调查一次。 2 DB44/T 2207—2019 6.2 病情分级标准 辣椒病情级别及其相对应的症状描述见表1。 表1 辣椒脉斑驳病毒引起的辣椒病毒病病情分级标准 病情级别 0 级 1 级 3 级 5 级 症状描述 全株无症状 心叶明脉或轻微花叶 少于1/3叶片花叶 1/3～1/2叶片花叶，叶片皱缩 7 级 9 级 1/2～2/3叶片花叶，叶片皱缩 2/3以上叶片花叶，叶片皱缩，有泡状突起 6.3 调查方法 接种15 d后，每隔15 d对每个接种植株发病情况进行调查，根据发病症状，按照附录B的格式记载 病情级别，按公式（1）计算出病情指数，待各处理病株的病情基本稳定，可以根据此时的病情指数对 待鉴定品种的抗性水平进行评价。 DI=∑（s×n）/（N×S）×100 ................................ (1) 式中： DI — 病情指数； s — 各病情指数级别的代表数值； n — 各病情级别的植株株数； N — 调查总植株数； S — 最高病情级别的代表数值。 7 抗性评价 7.1 抗性评价标准 根据待测材料4次重复的病情指数平均值确定其抗性水平，划分标准见表2。 表2 辣椒对辣椒脉斑驳病毒病抗性的评价标准 病情指数（DI） DI=0 0<DI<10 10≤DI<20 20≤DI<40 40≤DI<60 60≤DI 免疫 高抗 抗病 中抗 感病 高感 抗性评价 Immune (I) Highly resistant（HR） Resistant（R） Moderately resistant（MR） Susceptible（S） Highly susceptible（HS） 7.2 鉴定有效性鉴别 当同批次设置的感病品种达到相应感病程度（DI ≥40），该批次抗性鉴定视为有效。 8 鉴定报告的撰写 参照附录C的格式出鉴定报告。 3 DB44/T 2207—2019 AA 附 录 A （规范性附录） 辣椒脉斑驳病毒（ChiVMV-GD）的毒原准备 A.1 病样采集 从广东辣椒主产区采集表现皱缩、花叶、斑驳、褪绿等症状的辣椒病株细嫩叶片。 A.2 RT-PCR 检测 利用辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）的特异引物 ChiVMV-F（5’CGAGTCTCATAAGT AATTGCAC-3’）/ChiVMV-R（5’–AAGACATTTACTGATACCCTCC-3’） 对病样进行RT-PCR 检测，若能扩增出一条预期大小为752 bp的特异片段，病样中确定存在ChiVMV（图A.1）。RT-PCR反应 扩增体系为：PrimeScript 1 step Enzyme mix 2 μL，2×1 step Buffer（Dye Plus）25 μL，10 μM 引物ChiVMV-F/ChiVMV-R各1 μL，模板1 μL，加RNase-free ddH2O至总体积为50 μL。反应条件为： 50℃反转录30 min；94℃预变性4 min，94℃变性30 min、52℃退火30 sec、72℃延伸1 min，35个循环， 72℃最终延伸10 min，取8 μL扩增产物在质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶上 100 V～125 V恒压电泳30 min，在紫外检测仪下观察并记录结果。 图A.1 辣椒病样中 ChiVMV 的 RT-PCR 检测结果 1-5：疑似病样；6：阳性对照；7，8：阴性对照 A.3 病原分离纯化 采用人工摩擦将病液接种到枯斑寄主三生烟上，分离与纯化病样中的ChiVMV。接种后14 d左右，接 种叶片上产生坏死枯斑（图A.2），将产生的单斑切下，接种到健康三生烟植株上，进行二次纯化。 4 DB44/T 2207—2019 图A.2 ChiVMV 接种三生烟的症状 A.4 扩繁保存 将经过二次纯化后的单斑叶组织汁液摩擦接种于健康的辣椒感病品种植株上，接种10 d开始产生症 状，主要表现为新叶片上出现不规则暗绿斑驳，深绿部分通常伴有泡状凸起症状，叶边缘皱缩或卷起， 有的叶片变小畸形，甚至出现线叶，有些叶片的叶脉明显突出（图A.3）。新叶显症后，进行RT-PCR检 测，确保ChiVMV得到纯化。取显症叶片制备接种病原，或保存于-80℃冰箱中备用。 图A.3 ChiVMV 接种辣椒的症状 5 DB44/T 2207—2019 BB 附 录 B （资料性附录） 调查记录表 表B.1 辣椒品种抗辣椒脉斑驳病毒鉴定调查记录表 播种时间 品种名称 处理 接种时间 调查时间 各级病情株数 0 1 3 5 7 9 总株数 1-1 品种1 1-2 1-3 1-4 2-1 品种2 2-2 2-3 2-4 鉴定技术负责人（签字）： 6 复核人（签字）： 病情 平均 指数 病指 DB44/T 2207—2019 CC 附 录 C （资料性附录） 鉴定报告 表C.1 辣椒品种抗病毒鉴定报告 鉴定作物 辣椒 鉴定内容 __个品种对辣椒脉斑驳病毒的抗性水平 鉴定时间 ____年__月__日 至 ____年 __月__日 鉴定单位（盖章） 鉴定人（签字） 报告正文（必须附上原始调查数据相关附件） 7 DB44/T 2207—2019 DD 附 录 D （资料性附录） 溶液的配制 D.1 10% 磷酸三钠溶液 称取30 g磷酸三钠加入水中溶解，定容到100 mL。 D.2 磷酸缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.2） 磷酸二氢钾（KH2PO4） 磷酸氢二钠（Na2HPO4） 加水定容到1 L。 8 0.2 g 2.9 g DB44/T 2207—2019 参 考 文 献 [1] 汤 亚 飞 , 裴 凡 , 于 琳 , 等 . 侵 染