ICS 65.020.20 B 31 DB44 广 东 省 地 方 标 准 DB44/T 2206—2019 冬瓜品种抗小西葫芦黄花叶病毒 鉴定技术规程 The regulation for resistance evaluation of wax gourd to zucchini yellow mosaic virus 2019 - 10 - 31 发布 广东省市场监督管理局 2020 - 01 - 31 实施 发 布 DB44/T 2206—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准附录A为规范性附录，附录B、C、D为资料性附录。 本标准由广东省农业农村厅提出并归口。 本标准主要起草单位：广东省农业科学院植物保护研究所、湖南省植物保护研究所。 本标准主要起草人：何自福、汤亚飞、佘小漫、刘勇、蓝国兵、邓铭光、于琳、李正刚。 I DB44/T 2206—2019 冬瓜品种抗小西葫芦黄花叶病毒鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了冬瓜品种抗小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）鉴定技术的 术语和定义、毒原准备、人工接种抗性鉴定、病情调查、抗病性评价及鉴定报告的撰写。 本标准适用于冬瓜品种及材料对小西葫芦黄花叶病毒的人工接种抗性鉴定。 2 术语与定义 下列术语和定义适合于本标准。 2.1 小西葫芦黄花叶病毒 Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV 小西葫芦黄花叶病毒为马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员，具有马 铃薯Y病毒属成员基因组结构的典型特征，主要依靠蚜虫以非持久方式传播，也可以通过病株汁液和机 械接触等方式传播，但不能通过种子传播，主要侵染冬瓜、黄瓜、西葫芦、甜瓜、西瓜等葫芦科作物。 ZYMV侵染的植物出现花叶、斑驳、褪绿黄化、叶面凸凹不平、卷曲畸形、新叶变小、果实畸形、果面颜 色不均匀或产生褐斑等症状，或植株出现矮化，新梢坏疽，甚至凋萎死亡。 2.2 毒原 virus source 毒原ZYMV-DG：采自广东冬瓜主产区的典型病样，经检测、纯化、鉴定、扩繁后，保存的用于后续 实验的样品。 2.3 人工机械摩擦接种 artificial mechanical inoculation 通过人工操作，在供试植物叶面上造成微小伤口，使病毒从伤口进入细胞内而引起发病的过程。 2.4 抗病性鉴定 identification of disease resistance 采用合适的技术方法，鉴定作物对特定病害的抗性水平。 3 毒原 ZYMV-DG 准备 从广东冬瓜主产区采集表现花叶、斑驳、泡状突起等症状的病叶，经RT-PCR确定病样中存在ZYMV， 然后通过摩擦接种到能产生枯斑的健康苋色藜植株叶片上，经2至3次单斑分离，将分离后的病源接种到 健康的冬瓜植株上繁殖，待接种植株显症后进行分子检测，测序确定无误后，采集病叶，放置-80℃保 存备用。具体见附录 A。 1 DB44/T 2206—2019 4 仪器设备 电子天平，研钵，超低温冰箱，量筒，普通冰箱，PCR 仪，电泳仪，凝胶成像系统，移液器，离心 机，恒温水浴锅。 5 人工接种抗性鉴定 5.1 接种室 室内抗性鉴定应在具备良好发病环境的60目防虫日光温室中进行。 5.2 育苗 将冬瓜种子用温水浸种2 h～4 h，放置在28℃恒温培养箱催芽至露白，直播于8 cm×12 cm黑色塑 料育苗杯中，每杯2粒。播种用基质土为经121℃湿热灭菌消毒30 min的新鲜育苗基质土。育苗在60目防 虫日光温室内进行，室内温度应控制在25℃～30℃，确保幼苗为生长健壮、长势一致的无病苗。 5.3 鉴定品种设置 鉴定品种随机排列设置，4次重复，每个处理30株。 5.4 接种 5.4.1 接种时间 挑选健康无病的冬瓜苗，在子叶期进行接种。 5.4.2 接种病原制备 1 g新鲜或-80℃保存的病原病毒感染的发病叶组织加10 mL磷酸缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.2，见 附录D），在灭菌的研钵中匀浆，再经灭菌的纱布过滤，其滤液为接种悬浮液。 5.4.3 接种方法 在叶面上撒少量400目～600目金刚砂，然后用棉签蘸取接种悬浮液在叶片上沿叶脉方向轻轻摩擦， 再用清水将叶面多余的悬浮液和金刚砂轻轻洗去。 5.4.4 接种后的管理 供试幼苗置于接种室内继续培养，保持接种室温度为25℃～30℃，自然光照，常规水肥栽培管理。 6 病情调查 6.1 调查时间 接种后7 d～35 d进行，每隔7 d调查一次。 6.2 病情分级标准 冬瓜苗期病情级别及其相对应的症状描述见表1。 2 DB44/T 2206—2019 表1 小西葫芦黄花叶病毒引起的冬瓜病毒病病情分级标准 病情级别 症状描述 0 级 全株无症状 1 级 心叶脉明或轻花叶 3 级 心叶及中部叶片花叶 5 级 心叶及中部叶片花叶，少数叶片畸形、皱缩，植株轻度矮化 7 级 重花叶、多数叶片畸形、皱缩，植物矮化 9 级 重花叶、叶片明显畸形，植株严重矮化，甚至死亡 6.3 调查方法 接种7 d后对每个接种植株发病情况进行调查，之后每隔7 d调查一次，根据发病症状，按照附录B 的格式记录病情级别，按公式（1）计算出病情指数，待各处理病株的病情基本稳定，可以根据此时的 病情指数对待鉴定品种进行抗病性鉴定。 DI=∑（s×n）/（N×S）×100 ............................... (1) 式中： DI — 病情指数； s — 各病情指数级别的代表数值； n — 各病情级别的植株株数； N — 调查总植株数； S — 最高病情级别的代表数值。 7 抗性评价 7.1 抗性评价标准 根据待测品种4次重复的病情指数平均值确定其抗性水平，划分标准见表2。 表2 冬瓜对小西葫芦黄花叶病毒抗性的评价标准 病情指数（DI） DI=0 0<DI<10 10≤DI<20 20≤DI<40 40≤DI<60 60≤DI 抗性评价 免疫 Immune（I） 高抗 Highly resistant（HR） 抗病 Resistant（R） 中抗 Moderately resistant（MR） 感病 Susceptible（S） 高感 Highly susceptible（HS） 7.2 鉴定有效性鉴别 当同批次设置的感病品种达到相应感病程度（DI≥40），该批次抗性鉴定视为有效。 8 鉴定报告的撰写 参照附录C格式出鉴定报告。 3 DB44/T 2206—2019 AA 附 录 A （规范性附录） 小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV-DG） 的毒原准备 A.1 病样采集 从广东冬瓜主产区采集表现明显花叶、斑驳、泡状突起等症状的病叶。 A.2 病原 RT-PCR 检测 利用小西葫芦黄花叶病毒（ Zucchini yellow mosaic virus ，ZYMV）的特异引物 ZYMV-F（5’GATCACAAAG AAAATGTCATTGCCAC-3’）/ ZYMV –R（5’ –TGCTTTCATCTGCGCAACAG-3’）对病样进行 RT-PCR 检 测，若能扩增出一条预期大小为520 bp的特异片段，病样中确定存在ZYMV（图A.1）。RT-PCR反应扩增 体系为：PrimeScript 1 step Enzyme mix 2 μL，2×1 step Buffer（Dye Plus）25 μL，10 μM引物 ZYMV-F/ZYMV-R 各1 μL，模板 1 μL，加 RNase Free ddH2O 至总体积为 50 μL。反应条件为：55℃反 转录30 min；94℃预变性4 min，94℃变性30 min、52℃退火30 sec、72℃延伸1 min，35个循环，72℃ 最终延伸10 min，取8 μL扩增产物在质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶上100 V～125 V恒压电泳30 min，在 紫外检测仪下观察并记录结果。 图A.1 疑似病样中 ZYMV 的 RT-PCR 检测结果 1-5：疑似病样；6：阳性对照；7,8：阴性对照 A.3 病原分离纯化 采用人工接种方式通过机械摩擦接种方法将病样悬浮液接种到枯斑寄主苋色藜上，分离与纯化病样 中的ZYMV。接种后10 d左右，接种叶片上产生坏死枯斑（图A.2），将产生的单斑切下，再接种到健康 苋色藜植株上，进行二次纯化。 4 DB44/T 2206—2019 图A.2 ZYMV 接种苋色藜的症状 A.4 扩繁保存 将经过2次纯化后的单斑叶组织汁液摩擦接种于健康的冬瓜感病品种植株上，接种7 d开始产生症 状，主要表现为新叶片上出现不规则暗绿斑驳，深绿部分通常伴有泡状凸起症状（图A.3）。新叶显症 后，进行RT-PCR病原检测，确保ZYMV得到纯化，取显症叶片制备接种病原，或保存于-80℃冰箱中备用。 图A.3 ZYMV 接种冬瓜的症状 5 DB44/T 2206—2019 BB 附 录 B （资料性附录） 调查记录表 表B.1 冬瓜品种抗小西葫芦黄花叶病毒鉴定调查记录表 播种时间 品种名称 处理 接种时间 调查时间 各级病情病株数 0 1 3 5 7 9 总株数 病情 平均 指数 病指 1-1 品种1 1-2 1-3 1-4 2-1 品种2 2-2 2-3 2-4 C D ： 鉴定技术负责人（签字） 鉴定技术负责人（签字）： 6 复核人（签字）： 复核人（签字）： DB44/T 2206—2019 EC 附 录 C （资料性附录） 鉴定报告 表 C.1 冬瓜品种抗小西葫芦黄花叶病毒鉴定报告 鉴定作物 冬瓜 鉴定内容 ___个品种对小西葫芦黄花叶病毒的抗性水平 鉴定时间 ____年__月__日 至 ____年__月__日 鉴定单位（盖章） 鉴定人（签字） 报告正文（必须附上原始调查数据相关附件） 7 DB44/T 2206—2019 FD 附 录 D （资料性附录） 溶液的配制 D.1 磷酸缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.2） 磷酸二氢钾（KH2PO4） 磷酸氢二钠（Na2HPO4） 加水定容到1 L。 8 0.2 g 2.9 g DB44/T 2206—2019 参 考 文 献 [1] 尤毅,李华平,谢大森.侵染冬瓜的病毒病原种类鉴定.植物保护,2016,42(02):182-186. [2] 赵芹,谢大森,何晓明,等.广东地区冬瓜感染的小西葫芦黄花叶病毒检测及其外壳蛋白基因多 样性分析.园艺学报,2016,43(01):151-160. [3]