ICS 65.020.20 B 05 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1649—2019 蒙树 1 号杨和蒙树 2 号杨组培育苗技术规程 Tissue culture and rapid propagation technique guideline for Populus mengshu-1 and mengshu-2 2019-05-20 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2019-08-20 实施 发布 DB15/T 1649—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 环境及器具灭菌 .................................................................... 1 5 培养基配制 ........................................................................ 2 6 外植体及其灭菌 .................................................................... 3 7 初代培养 .......................................................................... 4 8 继代培养 .......................................................................... 4 9 生根培养 .......................................................................... 4 10 炼苗 ............................................................................. 5 11 大田移栽 ......................................................................... 6 附录 A（资料性附录） MS 培养基母液配制表 ............................................ 7 I DB15/T 1649—2019 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。 本标准起草单位：内蒙古和盛生态科技研究院有限公司、内蒙古和盛生态育林有限公司、内蒙古蒙 树生态环境有限公司、北京林业大学。 本标准起草人：赵泉胜、田菊、康向阳、铁英。 II DB15/T 1649—2019 蒙树 1 号杨和蒙树 2 号杨组培育苗技术规程 1 范围 本标准规定了蒙树1号杨和蒙树2号杨环境及器具灭菌、培养基配制、外植体采集及灭菌、初代培养、 继代培养、生根培养、炼苗、大田移栽等基本内容和技术要求。 本标准适用于蒙树1号杨和蒙树2号杨组织培养技术生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 LY/T 1882-2010 林木组织培养育苗技术规程 3 术语和定义 LY/T 1882-2010界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 蒙树 1 号杨 Populus mengshu-1 以毛新杨(Populus tomentosa × P. bolleana)为母本，银灰杨(P. canescens)为父本杂交而得的 雌株新品种。 3.2 蒙树 2 号杨 Populus mengshu-2 以毛新杨为母本，银灰杨为父本杂交而得的雄株新品种。 4 环境及器具灭菌 4.1 准备室消毒灭菌 经常用消毒液消毒，保持室内清洁。 4.2 接种室消毒灭菌 保持室内清洁。接种前用紫外灯照射30 min～40 min，关闭紫外灯20 min后方可进入。 4.3 培养室消毒灭菌 经常用消毒液对地面、组培架等设施进行消毒。 1 DB15/T 1649—2019 4.4 超净工作台消毒灭菌 接种前应用紫外灯照射30 min～40 min，打开无菌风吹40 min以上；然后用70 %酒精棉擦拭台面。 定期清洗超净工作台的过滤膜，具体方法：摘下滤膜，使用流水冲洗干净，晾干，安装，紫外灯照射灭 菌。 4.5 器具消毒灭菌 4.5.1 接种器具消毒灭菌 接种前，将接种工具用滤纸包好，置于高压灭菌锅灭菌，要求温度121 ℃、时间30 min。使用前用 酒精灯外焰灼烧20 s以上，或用接种工具灭菌器直接灭菌。 4.5.2 污染瓶消毒灭菌 用高压灭菌锅消毒，然后再用自来水清洗培养瓶。 5 培养基配制 5.1 基本培养基选择 选择MS培养基为基本培养基。 5.2 母液的配制和保存 5.2.1 母液的配制 MS培养基母液配制成几种化合物的混合母液，A液配制成20倍母液，B、C液配制成100倍母液，D液 配制成200倍母液，E液配制成50倍母液，具体参数参见附录A。 植物生长调节物质配制浓度为0.5 mg/L。 5.2.2 母液的保存 母液配制好后，标识清楚母液名称、倍数和配制日期，并置于4 ℃环境下存放。注意每瓶试剂在使 用前应目测无结晶、无异色时才能使用。 5.3 培养基制备 5.3.1 准备工作 准备好蒸馏水、蔗糖、琼脂、各类母液和激素等试剂药品，同时准备好移液枪、量筒、量杯、天平、 药匙、pH试纸等工具。 5.3.2 蔗糖和琼脂准备 按30 g蔗糖/L培养基液和6 g琼脂/L培养基液的用量称取蔗糖和琼脂的重量，置于加热容器中备用。 5.3.3 加母液 配制初代和继代培养基时，用量筒取A液母液、B液母液、C液母液、D液母液、E液母液分别为50 ml/L、 10 ml/L、5 ml/L、5 ml/L、10 ml/L，混合均匀。 2 DB15/T 1649—2019 配制生根培养基时，A液母液、B液母液、C液母液、D液母液、E液母液分别为25 ml/L、10 ml/L、5 ml/L、5 ml/L、10 ml/L，混合均匀。 配制初代培养基时，蒙树1号杨和蒙树2号杨于混合液中均添加 6-BA 0.30 mg/L和 NAA 0.05 mg/L。 配制继代培养基时，蒙树1号杨于混合液中添加 6-BA 0.30 mg/L和 IBA 0.20 mg/L，蒙树2号杨于 混合液中添加 6-BA 0.50 mg/L和 IBA 0.2 mg/L。 配制生根培养基时，蒙树1号杨于混合液中添加 IBA 0.30 mg/L和 NAA 0.20 mg/L，蒙树2号杨于混 合液中添加 IBA 0.30 mg/L和 NAA 0.10 mg/L。 5.3.4 母液定容 将量取好的母液定容至目标量。 5.3.5 加热溶解 将定容好的母液以及称量好的蔗糖和琼脂混合在一起加热，待蔗糖和琼脂全溶解，且液体沸腾时停 止加热。 5.3.6 pH 值调节 充分搅拌后，用1 mol/L的HCl或1 mol/L的NaOH调节至pH 5.8～6.0。 5.3.7 分装 使用350 ml规格的培养瓶定量分装，每瓶分装约50 ml。 5.3.8 封口 利用培养瓶配套瓶盖封口，拧紧瓶盖。 5.3.9 标记 封口后，在瓶盖上标注培养基名称、配制人、配制日期。 5.3.10 灭菌 8个小时内用高压灭菌锅灭菌，温度121 ℃，时间20 min。 5.3.11 冷却 灭菌后的培养基在凝固前取出，置于架上冷却凝固，2 d～3 d观察无染菌情况后使用。 5.3.12 贮存 灭菌后的培养基在室温条件下储存时，要在7 d内使用完毕。4 ℃存储时，要在15 d内使用完毕。 6 外植体及其灭菌 6.1 外植体采集 1～3月采集健壮、无病虫害的木质化枝条，进行切枝水培，选用新抽出的5 cm～10 cm带腋芽嫩茎 段为外植体。 3 DB15/T 1649—2019 6.2 外植体灭菌 去掉嫩茎的叶片和叶柄，在20%洗洁精或洗衣粉水中浸泡15 min后用毛笔将茎段刷洗干净，之后流 水冲洗30 min，置于无菌培养瓶中转移到超净工作台。用75%的酒精浸泡10 s，倒出酒精后立即用0.1% 升汞溶液浸泡5 min，无菌水漂洗5次去除残余消毒液。 7 初代培养 7.1 初代培养基 选择5.3.3中激素配比的初代培养基。 7.2 初代接种 超净工作台中，在无菌滤纸上将灭菌后的嫩茎切成长度约1 cm左右带腋芽的小段，每瓶培养基接种 1个小段，腋芽朝上斜插于培养基中，露芽，拧紧瓶盖，注明编号。 7.3 培养条件 培养温度为25 ℃±2 ℃，光照强度为2000 lx，光照周期为14 h光/10 h暗。 8 继代培养 8.1 继代培养基 选择5.3.3中激素配比的继代培养基。 8.2 继代转接 无菌外植体萌发的腋芽长到3 cm～4 cm高时，进行继代转接。在超净工作台内，将初代培养的无根 瓶苗切成长度2 cm左右的小段，每个小段上1～2个芽。每瓶培养基均接种6～7个小段。小段形态学下端 插入培养基内，露芽，盖紧瓶盖，注明编号。 8.3 培养条件 培养温度为25 ℃±2 ℃，光照强度为2000 lx，光照周期为12 h光/12 h暗。 8.4 培养期 继代培养期为20 d～30 d。 9 生根培养 9.1 生根培养基 选择5.3.3中激素配比的生根培养基。 4 DB15/T 1649—2019 9.2 生根转接 继代苗木长到3 cm～4 cm高时，进行生根转接。在超净工作台内，将继代培养的无根瓶苗切成长度 2 cm左右的小段，每个小段上含1～2个芽，每瓶培养基接种8～10个小段。小段形态学下端插入培养基 内，插入深度为3 mm～5 mm，露芽，保持直立，盖紧