ICS 11.220 B 41 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1854—2019 蜜蜂以色列急性麻痹病毒病诊断技术 Diagnostic techniques for Israeli acute paralysis virus of honey bees 2019 - 09 - 11 发布 福建省市场监督管理局 2019 - 12 - 11 实施 发 布 DB35/T 1854—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 缩略语 ............................................................................ 1 4 疾病概述 .......................................................................... 1 5 临床诊断 .......................................................................... 2 6 实验室诊断 ........................................................................ 2 7 结果判定 .......................................................................... 5 附录 A（规范性附录） 溶液的配制 ...................................................... 7 附录 B（资料性附录） 参考序列 ........................................................ 8 附录 C（资料性附录） 核酸扩增电泳图 .................................................. 9 I DB35/T 1854—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由福州海关提出并归口。 本标准起草单位：福州海关、海口海关、福建农林大学、长春海关、厦门瑞德利校准检测技术有限 公司、东莞市中鼎检测技术有限公司、福建省国鼎检测技术有限公司。 本标准主要起草人：张体银、郑腾、李丹丹、王武军、张志灯、黄少康、宋战昀、廖善胜、白泉阳、 林杰、于师宇、曹维强、李厚标。 II DB35/T 1854—2019 蜜蜂以色列急性麻痹病毒病诊断技术 1 范围 本标准规定了蜜蜂以色列急性麻痹病毒病的疫病概述、临床诊断、实验室诊断和结果判定。 本标准适用于蜜蜂以色列急性麻痹病毒病的诊断和蜜蜂以色列急性麻痹病毒感染的监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值：循环阈值（Cycle Threshold） DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethy Pyrocarbonate） dNTP：三磷酸脱氧核苷酸（Deoxynucleoside Triphosphate） EB：溴化乙锭（Ethidium Bromide） IAPV：以色列急性麻痹病毒（Israeli Acute Paralysis Virus） RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid） RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction） TBE：三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（Trihydroxymethyl Aminomethane-Boric Acidethylene Diamine Tetraacetic Acid） 4 疾病概述 以色列急性麻痹病毒病是由IAPV引起的一种常见的蜜蜂病毒病，可侵染各个发育时期的蜜蜂个体 （卵、幼虫、蛹、成蜂）和蜂群各级型蜜蜂（工蜂、雄蜂和蜂王），给蜂群造成重大损失，对蜜蜂养殖 业危害大，目前该病在全球大部分地区分布。 IAPV属于小核糖核酸病毒总科（Picornaviridae），病毒基因组是由9 487个核糖核苷酸组成，它 的两个开放读码框被一个由184个核苷酸组成的基因间区域分开。靠5′端的开放读码框编码翻译与RNA 复制和蛋白质加工相关的、由1 900个氨基酸构成的非结构性多聚蛋白质，靠3′端的开放读码框编码翻 译用于加工不同衣壳蛋白的、由944个氨基酸组成的结构性多聚蛋白。IAPV有两个内核糖体进入位点， 一个位于5′端非翻译区，另一个位于两个开放阅读框之间的基因间区域，在衣壳蛋白的起始翻译合成 时起介导作用。内核糖体进入位点介导的翻译起始机制降低了病毒对寄主的依赖性，这种机制被认为是 病毒破坏宿主蛋白质翻译合成过程的方式之一。 1 DB35/T 1854—2019 5 临床诊断 5.1 临床表现 5.1.1 临床健康的蜂群短时间内大量成年工蜂突然消失。 5.1.2 在巢脾上只剩下蜂王、幼虫和一些未成年工蜂以及花粉等残留食物，且在蜂箱内并无死亡蜜蜂 的残存尸体，也没有其他寄生害虫的存在。 5.1.3 蜜蜂个体感染早期腹部、胸部逐渐变黑，翅膀颤抖，在蜂箱外的空地上转圈，既不采食也不能 飞行。 5.1.4 蜜蜂感染后期胸部绒毛脱落，最后麻痹抽搐而死。 5.2 初步诊断 当蜂群出现5.1中部分或全部临床表现时，可做出初步诊断，确认需要进行实验室诊断。 6 实验室诊断 6.1 设备、材料和试剂 6.1.1 设备 6.1.1.1 6.1.1.2 6.1.1.3 6.1.1.4 6.1.1.5 6.1.1.6 6.1.1.7 6.1.1.8 6.1.2 普通 PCR 扩增仪。 荧光 PCR 仪。 台式冷冻高速离心机（12 000 r/min）。 微量移液器（0.5 µL～10 µL、2 µL～20 µL、20 µL～200 µL、100 µL～1000 µL）。 水平电泳仪。 凝胶成像系统。 电子天平（感量 0.01 g）。 冰箱（2 ℃～8 ℃和–80 ℃）。 材料和试剂 6.1.2.1 6.1.2.2 6.1.2.3 6.1.2.4 6.1.2.5 6.1.2.6 6.1.2.7 6.1.2.8 6.1.2.9 6.1.2.10 6.1.2.11 6.1.2.12 6.1.2.13 6.1.2.14 2 试验用水应符合 GB/T 6682—2008 中一级水的规定。 焦炭酸二乙酯处理水（DEPC 水）。 Trizol 试剂。 三氯甲烷。 异丙醇。 无水乙醇。 10×One Step RNA PCR Buffer。 MgCl2。 dNTPs（含 dATP、dTTP、dGTP、dCTP）。 逆转录酶。 Taq DNA 聚合酶。 琼脂糖。 分子量标准（100 bp～1 000 bp）。 TBE 电泳缓冲液，配制方法按附录 A 中 A.1 的规定。 DB35/T 1854—2019 6.1.2.15 EB（10 mg/mL），配制方法按附录 A 中 A.2 的规定。 6.1.2.16 上样缓冲液，配制方法按附录 A 中 A.3 的规定。 6.1.2.17 DNA 纯化回收试剂盒。 6.2 引物、探针序列和对照样品 6.2.1 引物和探针序列 6.2.1.1 普通 RT-PCR 引物序列 IAPV-F1 5′-AAG GCT CAG CTA GGA TGA CAC-3′。 IAPV-R1 5′-TCA GGA TTT AAA GCC TCA CG-3′。 扩增片段约270 bp，用双蒸水溶解至10 μmol/L后，保存于-20 ℃备用。 6.2.1.2 荧光 RT-PCR 引物和探针序列 上游引物 IAPV-F2 5′-ACT AGT GGA CGA AGC GAG TT-3′。 下游引物 IAPV-R2 5′-TGT ACT GGG CAG TTA CAG CA-3′。 探针IAPV-P序列为 5′-FAM–CGG AAC GCC GCA TGT GTT ACC A–BHQ1-3′。 扩增片段约127 bp，用双蒸水溶解至10 μmol/L后，保存于-20 ℃备用。 6.2.2 对照样品 6.2.2.1 6.2.2.2 6.2.2.3 6.3 阳性对照为灭活的 IAPV 或单一感染 IAPV 的蜜蜂组织或含目的片段的 RNA。 阴性对照为灭活的其他蜜蜂病毒或未感染 IAPV 的蜜蜂组织或不含目的片段的 RNA。 空白对照用无菌水代替样品。 样品采集和保存 选择疑似感染的蜂群，挑取带有临床表现的蜜蜂或新鲜死亡蜜蜂10～20只；也可挑取单个病、死虫 或蛹2～3只装入无菌的小试管内；发现患病蜂王也可采取单个蜂王个体。若样品24 h内能送达实验室， 应2 ℃～8 ℃保存；若样品24 h内不能送达实验室，则应-20 ℃或更低温度保存。 对于无临床表现的蜂群也可采用上述采样和保存方法。 6.4 6.4.1 IAPV 的 RT-PCR 检测 RNA 提取 选取不超过200 mg～300 mg待鉴定幼虫虫体或成蜂蜂体，置于DEPC水处理过的研钵中，加入液氮进 行研磨，将研磨得到的粉末，快速转移至无RNA酶并经过液氮冷却的1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol 试剂，用移液器充分吹打10～20次，室温放置5 min；加入200 μL三氯甲烷，旋涡振荡30 s混匀，室温 放置15 min；4 ℃，12 000 r/min离心15 min；取上层水相至一新的离心管中，加等体积异丙醇，上下 颠倒数次混匀，-20 ℃放置20 min；4 ℃，12 000 r/min离心15 min；弃上清液，沉淀用1 mL 75%乙醇 清洗；4 ℃，10 00