ICS 11.220 B 41 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB22/T 3035—2019 普通级实验用猫杯状病毒抗体检测 ELISA 法 Detection of conventional experimental cat feline calicivirus ELISA method 2019 - 05 - 27 发布 吉林省市场监督管理厅 2019 - 06 - 17 实施 发 布 DB22/T 3035—2019 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。 本标准由吉林省科学技术厅提出并归口。 本标准起草单位：吉林大学。 本标准主要起草人：袁宝、刘明慧、任文陟、胡进平、陈健、高巍、刘殿峰、张嘉保、权福实、张 金玉。 I DB22/T 3035—2019 普通级实验用猫杯状病毒抗体检测 ELISA 法 1 范围 本标准规定了普通级实验用猫杯状病毒抗体ELISA检测方法的原理、材料、检测和结果判定。 本标准适用于普通级实验用猫杯状病毒检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 14926.50 实验动物 酶联免疫吸附试验 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 原理 包被于固相载体表面的已知抗原与待检血清中的特异性抗体结合形成免疫复合物，此抗原抗体复合 物可与相应的第二抗体酶结合物结合。在酶的催化作用下底物发生反应，产生有色物质。颜色反应的深 浅与待检血清中所含有的特异性抗体的量成正比。 4 材料 4.1 器材 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.2 酶标仪，波长 405 nm〜630 nm。 恒温培养箱，室温〜50 ℃ 。 离心机，1000 r/min〜4000r/min 和 30000 r/min〜 80000 r/min。 微量加样器， 5 µL〜50 µL 和 50 µL 〜200 µL。 聚苯乙烯板，96 孔，无菌。 试剂 4.2.1 4.2.1.1 抗原 标准阳性抗原 用 FCV标准毒株感染F81细胞，接种 3 天〜5 天，细胞融合 80% 以上时收获培养液。冻融 3 次后， 2000 r/min 离心（4.1.3）去除细胞碎片，上清液再经 40000 r/min 离心（4.1.3）浓缩后制成标准阳 性抗原。 4.2.1.2 标准阴性抗原 F81细胞冻融破碎后，经 2000 r/min 离心（4.1.3）去除细胞碎片获得的上清液制成标准阴性抗原。 1 DB22/T 3035—2019 4.2.2 血清 4.2.2.1 阳性血清 FCV 抗原免疫的普通级实验用猫血清。 4.2.2.2 阴性血清 无 FCV 感染的普通级实验用猫血清。 4.2.3 酶结合物 辣根过氧化物酶标记羊或兔抗猫 IgG 抗体。 4.2.4 包被液、洗涤液、稀释液、底物溶液和终止液 符合 GB/T 14926.50 要求。 5 检测 5.1 血清采集及处理 按照 NY/T 541 规定执行。 5.2 抗原包被 将标准阳性抗原和标准阴性抗原分别用包被液（4.2.4）稀释。每孔 100 µL，置培养箱（4.1.2） 37 ℃ 孵育 2 h，4 ℃ 过夜。 5.3 洗涤 用洗涤液（4.2.4）洗涤 5 次，每次 3 min，拍干。 5.4 加样 待检血清用稀释液（4.2.4）按1：20稀释，分别加入标准阳性抗原孔和标准阴性抗原孔，每孔100 µL， 同时设阴性、阳性和空白对照，置培养箱（4.1.2）37 ℃ 孵育 1 h～1.5 h，按 5.3 洗涤。 5.5 加酶结合物 用稀释液（4.2.4）将酶结合物按 1:1000 稀释，每孔加入100 µL，置培养箱（4.1.2）37 ℃ 孵 育 1 h～1.5 h，按 5.3 洗涤。 5.6 加底物溶液 每孔加入新配制的底物溶液（4.2.4）100 µL，置室温，避光显色 5 min～10 min。 5.7 终止反应 每孔加入终止液（4.2.4）50 µL。 5.8 测A值 用酶标仪（4.1.1）490 nm 波长测定各孔 A 值。 2 DB22/T 3035—2019 6 结果判定 6.1 在标准阳性血清 A 值 ≥0.2 且标准阳性血清 A 值 / 标准阴性血清 A 值 ≥ 2.1 时进行结果 判定。 6.2 待检血清 A 值/阴性血清 A 值 ≥ 2.1，判为抗体阳性，反之，判为抗体阴性。 _________________________________ 3