ICS 07.100.10 C 04 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 3052—2019 脑膜炎奈瑟菌检测 实时荧光 PCR 法 Detection of Neisseria-meningitidis in real-time fluorescent polymerase chain reaction method 2019 - 05 - 27 发布 吉林省市场监督管理厅 2019 - 06 - 17 实施 发 布 DB22/T 3052—2019 前 言 本标准按照G GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。 本标准由吉林省卫生健康委员会提出并归口。 本标准起草单位：吉林省疾病预防控制中心。 本标准主要起草人：张炜煜、杨修军、刘桂华、王慧、张立夫、王艳秋。 I DB22/T 3052—2019 脑膜炎奈瑟菌检测 实时荧光 PCR 法 警示——使用本标准的人员应该有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问 题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了脑膜炎奈瑟菌实时荧光PCR法的试剂和材料、仪器设备、试验步骤和数据处理技术要 求。 本标准适用于在生物安全二级实验室或以上防护级别的实验室中进行流行性脑脊髓膜炎疑似病人 的脑脊液、血液、咽拭子样本中脑膜炎奈瑟菌检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 WS/T 230 临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术应用 3 原理 根据脑膜炎奈瑟菌荚膜转运基因（CtrA）的保守序列，设计TaqMan荧光探针和引物。PCR扩增时， Taq酶的5'端-3'端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，荧光监测系统可 接收到荧光信号。荧光信号累积与PCR产物形成同步，实时在线监控反应过程，对扩增产物进行分析。 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 试剂和材料 除特别说明以外，所有试剂为分析纯或生化试剂。 细菌基因组 DNA 提取试剂盒。 0.1%DEPC 处理后的去离子水，符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 Fast TaqMan Mixture(Low ROX)。 阳性质控品：脑膜炎奈瑟菌标准菌株。 阴性质控品：非目标菌株。 引物和探针序列： 1 DB22/T 3052—2019 细菌名称 序列 扩增产物 长度/bp 脑膜炎奈瑟菌 F: 5'-GGTATATCGTGTGAATATGGCTGATG -3' R: 5'-GGCGCATTCGACACATACAA -3' Pb: 5'-(FAM) CGCTATTTTCTATGCAGCGCTTTCCTGTG (SpC6) -3' 97 注：上下游引物和探针工作液浓度均为10 μmol/L。 5 仪器和设备 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.1.5 5.1.6 5.1.7 5.1.8 5.1.9 6 Ⅱ级生物安全柜。 荧光定量 PCR 仪。 涡旋振荡器。 冰箱（2 ℃～8 ℃和-20 ℃）。 离心机(13000 rpm)。 微量可调移液器及配套带滤芯吸头（10μL，100μL，200μL，1000μL）。 金属浴或水浴锅。 离心管（1.5mL）。 荧光 PCR 反应管和盖。 试验步骤 6.1 样品 6.1.1 培养物 用接种环挑取培养基上疑似菌落，置于含200 μL 无菌双蒸水的离心管（5.5）中，用涡旋振荡器 （5.3）振荡混匀。 6.1.2 血液 采集3 mL～5 mL静脉血置于抗凝管中，并标记。 6.1.3 脑脊液 应由经验丰富的专业人员在无菌条件下操作。采集1 mL脑脊液置于无菌、螺帽管中，并标记。 6.1.4 咽拭子 将咽拭子绕过口腔悬雍垂擦拭后壁，并置于底部滴加3 滴～5 滴无菌生理盐水的试管中，待检。 6.2 DNA 提取 对于上述标本，在Ⅱ级生物安全柜（5.1）取0.1 mL（5.6）加到一个盛有0.2 mL无菌双蒸水的离心 管中（5.8）中，振荡混匀，用金属浴或水浴锅（5.7）100 ℃煮沸10 min，使用离心机（5.5）以13 000 rpm/min离心 5 min，可吸取上清液作为DNA模板。也可使用细菌基因组DNA提取试剂盒并按其说明提取 制备DNA模板。不能及时检测的DNA模板可置于-20 ℃冰箱（5.4）保存。 2 DB22/T 3052—2019 6.3 Real-time PCR 扩增 6.3.1 Real-time PCR 反应体系 Real-time PCR反应体系：20 μL。其中，Fast TaqMan Mixture （4.3）10 μL，上下游引物各1 μL、 探针0.2 μL，参比荧光 Rox 0.4 μL，DNA模板2 μL，DEPC水（4.2）5.4 μL。振荡混匀，短暂离心。同 时设阳性对照、阴性对照、空白对照。 6.3.2 Real-time PCR 反应参数 预变性95 ℃ 3 min；变性95 ℃ 5 s，退火延伸55 ℃ 1 min，在此收集荧光，共40 个循环。 7 结果判定 7.1 阈值的设定 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根据仪器噪音情况 进行调整。 7.2 7.2.1 7.2.2 7.2.3 7.2.4 7.3 质量控制 阳性对照 Ct 值应≤35，并出现特定的扩增曲线。 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。 空白对照无 Ct 值并且无扩增曲线。 如阴性对照和阳性对照不满足以上条件，此试验视为无效。 结果判定 待测样本的Ct 值小于等于35，扩增曲线呈光滑的S型，判定为脑膜炎奈瑟菌阳性；待测样本的无Ct 值，判定为脑膜炎奈瑟菌阴性；待测样本的Ct 值大于35，小于40时，应重新检测；重新检测结果大于 等于40时，判定为脑膜炎奈瑟菌阴性；小于等于35时，判定为脑膜炎奈瑟菌阳性。 8 试验报告 试验报告至少应给出以下几个方面内容： ——试验对象； ——所使用的标准（包括发布或出版年号） ——所使用的方法（如果标准中包括几个方法） ——结果； ——观察到的异常现象； ——试验日期。 9 9.1 9.2 废弃物处理和防止污染的措施 检验过程中的培养物和废物应小心处置，按 GB 19489 规定执行。 检验过程中防止交叉污染措施按 WS/T 230 规定执行。 _________________________________ 3