ICS 11.220 B 41 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB22/T 3031—2019 禽流感和新城疫病毒荧光 RT-PCR 检测法 One step fluorescent RT-PCR method for simultaneous detection of the AIV and NDV 2019 - 05 - 27 发布 吉林省市场监督管理厅 2019 - 06 - 17 实施 发 布 DB22/T 3031—2019 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：吉林大学。 本标准起草人：尹仁福、刘新鑫、丁壮、李俊娇、费亦东、范钦磊、肖玉海。 I DB22/T 3031—2019 禽流感和新城疫病毒荧光 RT-PCR 检测法 1 范围 本标准规定了禽流感和新城疫病毒荧光RT-PCR 检测方法的原理、试验条件、试剂或材料、仪器设 备、样品、检测方法和结果。 本标准适用于禽流感和新城疫病毒检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 原理 通过提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA 作为模板，采用 Oligo（dT） 或随机引物利用 逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。通过该反 应，利用荧光标记的特异性的探针，对 PCR 产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的 软件对产物进行分析，最终计算待测样品模板的初始浓度。 4 4.1 试验条件 生物安全要求 所有培养物和废弃物的处置应按照 GB 19489 中的有关规定执行。 4.2 防污染措施 4.2.1 防止污染措施应符合 GB/T 27401 的规定。 4.2.2 实验室应根据实验要求分为相对独立的工作区域，避免不同工作区域内的设备、物品混用。每 一个区域应有专用的仪器设备。 5 5.1 试剂或材料 试剂 除有特殊说明外，所用试剂均为分析纯；试验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。 1 DB22/T 3031—2019 5.1.1 磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液 pH 值范围为 pH 7.0〜 pH7.4，成分为青霉素 2 000 U/mL、链霉 素 2 mg/mL、卡那霉素 50 µg/mL、制菌霉素 1 000 U/mL。 5.1.2 RNA 提取试剂盒。 5.1.3 荧光探针 RT-PCR 试剂盒。 5.1.4 采用无新城疫、禽流感病毒的阴性质粒作为阴性对照。 5.1.5 采用无 RNA 酶灭菌超纯水作为空白对照。 5.1.6 采用已构建出的新流感、新城疫病的的阳性质粒作为阳性对照。 5.2 材料 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.2.5 5.2.6 5.3 棉拭子。 雏禽新鲜粪便。 死禽。采取病料包括脑、肺脏、脾脏。 离心管。1.5 mL。 微量移液器枪头。1 000 µL、200 µL、10 µL。 荧光 PCR 管。 引物 引物及浓度见表1。 表1 靶基因 禽流感 检测引物 新城疫 检测引物 6 引物探针 荧光定量 PCR 方法所用引物和 TaqMan 探针序列 序列（5’～3’） 碱基数 工作浓度 F tatacgactcactatatcttctaaccgaggtcgaaacg 39 R ttcttccctgcaaagacatcttc 23 P fam-ccctcaaagccgagatcgcgc-tamra 21 引物 10 µmol/L F tatacgactcactatattgccagcacaaaaaggtctcc 39 探针 90 µmol/L R tcatcaccacctatccattcatctt 25 P vic-cttcctaggcagagcat-tamra 17 仪器设备 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 7 组织匀浆器。 旋涡振荡仪。 高速冷冻离心机。16 000 r/min。 冰箱。-80 ℃、-20 ℃、4 ℃。 微量移液器。 荧光定量 PCR 仪。Step One 型。 样品 7.1 采集 7.1.1 活禽采集的样品应包括气管和泄殖腔拭子（5.2.1），后者需带有可见粪便。雏禽可采用收集新 鲜粪便（5.2.2）代替。 2 DB22/T 3031—2019 7.1.2 7.2 死禽以脑、肺脏、脾脏（5.2.3）为主，也可采集其他病变组织。 处理 气管和泄殖腔拭子（5.2.1）放入PBS（5.1.1）中，4 ℃ 保存（6.4）。粪便（5.2.2）和搅碎（6.1） 的组织，用PBS（5.1.1）制成 10 %〜20 %的悬浮液（6.2）。 8 检测方法 8.1 RNA 模板的抽提 按试剂盒操作（5.1.2）。 8.2 反应体系 按荧光探针RT-PCR试剂盒（5.1.3）照表 2 中顺序加样（6.5）后，充分混匀并瞬时离心（6.3）放 入荧光PCR仪（6.6）。同时设立阴性对照（5.1.4）、空白对照（5.1.5）和阳性对照（5.1.6）。循环 参数见表 3。 表2 RT-PCR 反应体系配制表 试剂 体积/µL 预混料 10.0 DEPC水 6.4 上游引物 0.2 下游引物 0.2 探针 0.2 模板RNA 3 总计 20 表3 阶段 循环参数 反应条件 循环次数 第一阶段 42 ℃ 30 min 1 第二阶段 95 ℃ 10 min 1 第三阶段 95 ℃ 10 s a 60 ℃ 30 s a 9 9.1 40 在 60 ℃进行单点荧光检测。 结果 成立条件 3 DB22/T 3031—2019 若空白对照 Ct = 0 或 ＞ 40 且无完整的 S 型扩增曲线，阴性对照 Ct = 0 或 ＞ 40 且无完整 的S 型扩增曲线，阳性对照中禽流感和新城疫阳性质粒出现 Ct ＜ 32 且具有完整的S型扩增曲线，进 行结果判定。 9.2 判定 见表 4。 表4 检测引物 判定要求 Ct ＜ 32 AIV-M NDV-M 荧光定量 PCR 结果判定 判定结果 具有完整的 S 型扩增曲线 32 ≤ Ct ≤ 40 2 次以上重复试验均能得到完整的 S 禽流感病毒阳性 型扩增曲线 Ct =0 或 ＞ 40 无完整的 S 型扩增曲线 Ct ＜ 32 具有完整的 S 型扩增曲线 32 ≤ Ct ≤ 40 Ct = 0 或 ＞ 40 禽流感病毒阴性 2 次以上重复试验均能得到完整的 S 新城疫病毒阳性 型扩增曲线 无完整的 S 型扩增曲线 禽流感病毒阴性                                                                                                         _________________________________ 4