ICS 65.020.30 B 41 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB22/T 3038—2019 食用犬疫病实验室检测技术规程 Laboratory testing technical regulations of edible canine epidemic disease 2019 - 05 - 27 发布 吉林省市场监督管理厅 2019 - 06 - 17 实施 发 布 DB22/T 3038—2019 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：延边大学。 本标准主要起草人：金鑫、李香春、张皓、李成辉、陈竞、于建华、陆秀娟。 I DB22/T 3038—2019 食用犬疫病实验室检测技术规程 1 范围 本标准规定了食用犬主要疫病实验室检测技术的术语和定义、检测、废弃物处理和档案管理。 本标准适用于食用犬疫病实验室检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 18646-2018 动物布鲁氏菌病诊断技术 GB/T 27532-2011 犬瘟热诊断技术 GB/T 27533-2011 犬细小病毒诊断技术 GB/T 36789-2018 动物狂犬病病毒核酸检测方法 NY/T 1948 兽医实验室生物安全要求通则 NY/T 2961 兽医实验室 质量和技术要求 SN/T 4749-2017 犬传染性肝炎检疫技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 食用犬 edible dog 由人工养殖用做食用的犬只。 3.2 聚合酶链反应 polymerase chain reaction 对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的检测方法。 4 检测 4.1 检测项目 布氏杆菌病、犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病、犬传染性肝炎、钩端螺旋体病和利什曼病。 4.2 检测方法 4.2.1 布氏杆菌病 按 GB/T 18646-2018 规定的 PCR 执行。 1 DB22/T 3038—2019 4.2.2 犬瘟热 按 GB/T 27532-2011 规定的 RT-PCR 执行。 4.2.3 犬细小病毒病 按 GB/T 27533-2011 规定的 PCR 执行。 4.2.4 狂犬病 按 GB/T 36789-2018 规定执行。 4.2.5 犬传染性肝炎 按 SN/T 4749-2017 规定执行。 4.2.6 钩端螺旋体病 按附录 A 规定执行。 4.2.7 利什曼病 按附录 B 规定执行。 5 废弃物处理 按 NY/T 1948 规定执行。 6 档案管理 按 NY/T 2961 规定执行。 2 DB22/T 3038—2019 AA 附 录 A （规范性附录） 钩端螺旋体病荧光 PCR 检测方法 A.1 试剂 A.1.1 A.1.2 A.1.3 DNA 提取试剂盒。 荧光 PCR 预混液。 引物与探针，见表 A.1。 表A.1 名称 引物与探针序列及浓度 序列 浓度 上游引物 F CCCGCGTCCGATTAG 10 pmol/µL 下游引物 R TCCATTGTGGCCGRACAC 10 pmol/µL 探针 FAM-CTCACCAAGGCGACGATCGGTAGC-TAMRA 10 pmol/µL A.2 步骤 A.2.1 核酸提取 采集临床检测疑似病犬淋巴结，按DNA提取试剂盒方法提取DNA模板。 A.2.2 荧光PCR扩增体系 检测样本反应体系见表 A.2，同时设阴性、阳性对照。 表A.2 样品反应体系 体系组分 用 2╳PCR 预混液 10.0 µL 无酶核酸水 5.9 µL 上游引物 F 0.8 µL 下游引物 R 0.8 µL 探针溶液 0.5 µL DNA 模板 2.0 µL 总量 20.0 µL A.2.3 量 荧光PCR的扩增条件设置 将PCR管放入荧光 PCR 仪，扩增参数见表 A.3。 3 DB22/T 3038—2019 表A.3 温度 扩增参数 时间 95 ℃ 30 s 95 ℃ 15 s 60 ℃ a 1 min 循环次数 1 40 注：a 荧光收集设置每次循环的退火延伸时进行。 A.3 结果判定 A.3.1 条件设定 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根 据仪器噪音情况进行调整。 A.3.2 质控标准 阴性对照无 Ct值并且无扩增曲线，阳性对照的Ct值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线。 A.3.3 A.3.3.1 A.3.3.2 4 结果描述及判定 无 Ct 值并且无扩增曲线为阴性，表明样品中无钩端螺旋体。 Ct 值≤35.0，且出现特定的扩增曲线为阳性，表示样本中存在钩端螺旋体。 DB22/T 3038—2019 BB 附 录 B （规范性附录） 利什曼病荧光 PCR 检测方法 B.1 试剂 B.1.1 B.1.2 B.1.3 DNA 提取试剂盒。 荧光 PCR 预混液。 引物与探针，见表 B.1。 表B.1 引物与探针序列及浓度 名称 序列 浓度 上游引物 F GCGACGTCCGTGGAAAGAA 10 pmol/µL 下游引物 R GGCGGGTACACATTAGCAGAA 10 pmol/µL 探针 FAM-CAACGCGTATTCCC-TAMRA 10 pmol/µL B.2 步骤 B.2.1 核酸提取 采集临床检测疑似病犬淋巴结，按 DNA 提取试剂盒方法提取 DNA 模板。 B.2.2 荧光PCR扩增体系 检测样本反应体系见表 B.2，同时设阴性、阳性对照。 表B.2 样品反应体系 体系组分 用 2╳PCR 预混液 10.0 µL 无酶核酸水 5.9 µL 上游引物 F 0.8 µL 下游引物 R 0.8 µL 探针溶液 0.5 µL DNA 模板 2.0 µL 总 20.0 µL 量 B.2.3 量 荧光PCR的扩增条件设置 将 PCR 管放入荧光 PCR 仪，扩增参数见表 B.3。 5 DB22/T 3038—2019 表B.3 温度 时间 95 ℃ 30 s 95 ℃ 15 s 60 ℃ b 扩增参数 1 min 循环次数 1 40 注：b 荧光收集设置每次循环的退火延伸时进行。 B.3 结果判定 B.3.1 条件设定 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根 据仪器噪音情况进行调整。 B.3.2 质控标准 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线，阳性对照的 Ct 值应≤35.0，并出现特定的扩增曲线。 B.3.3 B.3.3.1 B.3.3.2 结果描述及判定 阴性无 Ct 值并且无扩增曲线，表明样品中无利什曼原虫。 阳性 Ct 值≤40.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在利什曼原虫。 _________________________________ 6