ICS 67.120.30 B 50 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2912—2018 贝类中霍乱弧菌检测 微滴数字 PCR 法 Determination of Vibrio cholerae in shellfish-droplet digital PCR method 2018 - 11 - 12 发布 吉林省市场监督管理厅 2018 - 12 - 30 实施 发 布 DB22/T 2912—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。 本标准由长春海关（原吉林出入境检验检疫局提出并归口）。 本标准起草单位：长春海关（原吉林出入境检验检疫局验检疫技术中心）、延边海关综合服务技术 中心（原延边出入境检验检疫局技术中心）。 本标准主要起草人：罗雁非、孙佳、杜佳剑、聂丹丹、丁旭、王准、曲辉、彭勃。 I DB22/T 2912—2018 贝类中霍乱弧菌检测 微滴数字 PCR 法 警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问 题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了贝类中霍乱弧菌检测微滴数字PCR法的试剂和材料、仪器和设备、样品、试验步骤和 试验数据处理与防止污染措施。 本标准适用于贝类中霍乱弧菌检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.1-2016 食品安全国家标准 食品卫生微生物检验 总则 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 SN/T 1022 进出口食品中霍乱弧菌检验方法 SN/T 2425-2010 进出口食品中霍乱弧菌快速及鉴定监测方法 实时荧光PCR方法 WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 3 原理 微滴式数字PCR平台通过产生微小油包水体系实现反应体系的分割，根据霍乱弧菌的溶血性特异性 基因序列对贝类中霍乱弧菌进行鉴定。经PCR扩增后，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可 得出靶分子的起始拷贝数或浓度，实现对霍乱弧菌的快速定性检测。 4 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水符合 GB/T 668 中二级水的要求。 4.1 裂解液,成分包括：2% CTAB(cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，100 mmol/L Tris(tris hydroxymethyl aminomethane，三羟甲基氨基甲烷)，1.4 mol/L NaCl， 20 mmol/L EDTA(ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)，用 HCl 调至 pH8.0。 4.2 酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v/v）。 4.3 氯仿。 4.4 异戊醇。 4.5 无水乙醇。 1 DB22/T 2912—2018 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 异丙醇。 70%乙醇。 2×dd PCR 预混液。 霍乱弧菌旋转酶（gyrase）基因引物和探针 上游引物：5’- GCCAAAATTGTGCGTATCAG -3’ 下游引物：5’- ATAATCTTGGGCAATCGCA -3’ 探针：5’-（FAM）- AACTGGCTTCCAAACTGACGATAACC -（TAMRA）-3’ 4.11 菌株：霍乱弧菌阳性标准菌株。 5 仪器和设备 5.1 微量移液器：0.1 μL～2.5 μL，1 μL～10 μL，2 μL～20 μL，10 μL～100 μL，20 μL～ 200 μL，100 μL～1 000 μL。 5.2 高速冷冻离心机(12 000 r/min)。 5.3 涡旋混合器。 5.4 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 5.5 微滴生成仪。 5.6 PCR 仪。 5.7 微滴读数系统。 6 样品 6.1 6.2 7 样品的采集按照 GB 4789.1-2016 中 3.1 的规定实施。 样品前处理按照 SN/T 1022 的规定执行。 试验步骤 7.1 增菌培养 按照SN/T 1022的规定执行。 7.2 样品 DNA 提取 7.2.1 用移液器（5.1）吸取霍乱弧菌增菌液 1 mL，加到 1.5 mL 无菌离心管中，12 000 r/min 离心（5.2） 10 min，吸弃上清；加入 50 μL DNA 裂解液（4.1），混匀（5.3）后沸水浴 5 min，12 000 r/min 离 心 5 min。取上清保存于 - 20 ℃备用。 7.2.2 按照 GB/T 19495.3 的规定进行 CTAB 提取法制备模板 DNA（4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7）， 或使用商业化的 DNA 提取试剂盒时按照其说明书操作。 7.3 DNA 浓度和纯度的测定 按照 GB/T 19495.3 的规定，用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计（5.4）260 nm和280 nm的测定 核酸含量，用双蒸水稀释至1 ng/μL～100 ng/μL备用。 7.4 2 微滴数字 PCR 反应体系 DB22/T 2912—2018 反应体系见表1。 表1 微滴数字 PCR 反应体系 试剂成分 体积 µL 2×dd PCR 预混液(4.8) 10 上游引物（10 µmol/L）（4.9） 1 下游引物 (10 µmol/L）（4.9） 1 探针(10 µmol/L）（4.9） 1 模板DNA（1 ng/μL ~100 ng/μL） 5 双蒸水 2 注1：空白对照实验时，用双蒸水替代样品DNA。 注2：阴性对照实验时，用非目标源性成分替代样品DNA。 注3：阳性对照实验时(4.10)，用霍乱弧菌阳性成分DNA。 7.5 微滴生成 利用微滴生成仪完成 20 µL 反应体系的分割（5.5）。 7.6 PCR 反应 反应条件：95 ℃ 5 min，1个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环；98 ℃/10 min（1 ℃ /s），12 ℃保存反应产物。体系完成后，进行数字PCR反应。 7.7 微滴读数 PCR反应完成后，选择FAM单荧光通道利用微滴读数系统（5.7）进行微滴读数。数字PCR反应的有效 分割体系数不得低于理论分割体系数的 50%。 8 试验数据处理 8.1 8.1.1 8.1.2 8.2 8.2.1 8.2.2 8.2.3 8.2.4 8.3 8.3.1 8.3.2 阈值限的设定 阈值限应对空白和阳性扩增结果进行区分。 按照数字 PCR 体系中阴性分割体系的终点荧光值设定。 质控标准 阳性对照为霍乱弧菌阳性基因有明显扩增，扩增终点荧光信号大于或等于阈值。 阴性对照为霍乱弧菌基因无扩增，扩增终点荧光信号小于阈值。 空白对照为霍乱弧菌基因无扩增，扩增终点荧光信号小于阈值。 与以上实验结果不符，需要重复验证实验步骤。 结果判定与报告 样品扩增终点荧光信号小于阈值，判为阴性，报告未检出霍乱弧菌。 样品扩增终点荧光信号大于或等于阈值，判为阳性，报告检出霍乱弧菌。 3 DB22/T 2912—2018 9 防止污染措施 按照 GB 19489 和 WS/T 230-2002 中 6 的规定执行。 _________________________________ 4