ICS 11.220 B 41 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB22/T 2984—2019 鹿粘膜病双抗夹心 ELISA 检测方法 Double antibody sandwich ELISA method for the detection of deer mucosal disease 2019 - 05 - 27 发布 吉林省市场监督管理厅 2019 - 06 - 17 实施 发 布 DB22/T 2984—2019 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。 本本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：长春市乾艺生物科技研究所、长春市农业科学院。 本标准主要起草人：田来明、赵春梅、张宇、李男、田桂华、申雨弘、崔鹤馨、权心娇、胡桂英、 付晓霞、王雨千。 I DB22/T 2984—2019 鹿粘膜病双抗夹心 ELISA 检测方法 警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。 使用者有责任采取适当的安全和健康措施，具体防护措施及要求按照 GB 19489 执行。 1 范围 本标准规定了鹿粘膜病双抗夹心ELISA检测方法的术语和定义、试剂、仪器设备、样品处理、操作 步骤和结果判定。 本标准适用于鹿粘膜病病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 鹿粘膜病 mucosal disease 由病毒性腹泻病毒（mucosal disease virus，MDV）引起的鹿传染病，可引起鹿呈多临床表现， 主要表现为腹泻、母鹿流产、不孕，产死胎、木乃伊胎或畸形胎等。 4 试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。 4.1 PBS，见表 A.1。 4.2 包被液，见表 A.2。 4.3 洗涤液，见表 A.3。 4.4 封闭液，见表 A.4。 4.5 pH 5.0 磷酸盐-柠檬酸缓冲液，见表 A.5。 4.6 底物溶液（OPD-H2O2），见表 A.6。 4.7 终止液，见表 A.7。 4.8 标准阳性，MDV NADL 国际标准株用牛肾继代细胞 MDBK 株培养增值，经反复冻融后制备。 4.9 标准阴性，pH7.4 PBS。 4.10 MDV 免疫球蛋白，见附录 B。 1 DB22/T 2984—2019 4.11 MDV 酶标抗体，见附录 C。 5 仪器设备 5.1 5.2 5.3 5.4 6 离心机，最高转速 15 000 r/min。 恒温培养箱，温度均匀度≤±1（37 ℃时） 酶联免疫检测仪，全波长酶标仪。 紫外分光光度计，200 nm～1 000 nm。 样品处理 6.1 样品采集 选择新鲜鹿粪 3 g ～5 g 装入洁净的食品塑料袋内，用封口机封口或结扎紧袋口后立即放入盛有 冰块的保温瓶（箱）内。每份样品的包装瓶（袋）上均要贴上标签，写明采集地点，编号，时间等。如 暂时不进行检测应－80 ℃保存。 6.2 样品处理 取 1 g 采集到的鹿粪样品加入10 mL PBS（5.1）中充分混匀，3 000 r/min离心（6.1）30 min， 上清液即为待检样品。 7 操作步骤 7.1 使用前将所有试剂恢复至室温。 7.2 在 ELISA 反应板中加入用包被液（5.2）稀释至 1.0 mg/mL MDV 免疫球蛋白（5.10）100 μL/孔， 37 ℃（6.2）包被 4 h。 7.3 弃去板中溶液，加洗涤液（5.3）300 μL/孔，轻微晃动反应板，3 min 后弃去洗涤液；如此操作 3 次，最后将 ELISA 反应板置于吸水纸上轻轻拍干。 7.4 然后加封闭液（5.4）100 μL/孔，37 ℃ 封闭 1 h。 7.5 重复 7.3 的操作。 7.6 加入待检样品 100 μL/孔，并设阳性对照（5.8）2 孔，阴性对照（5.9）2 孔，空白对照 1 孔，密 封 ELISA 反应板，37 ℃ 孵育 2 h 。 7.7 重复 7.3 的操作。 7.8 加入酶标抗体（5.11）100 μL/孔，密封 ELISA 反应板，37 ℃ 孵育 1 h。 7.9 重复 7.3 的操作。 7.10 避光环境下，加入底物溶液（5.6）100 μL/孔，室温放置 25 min。 7.11 加入终止液（5.7）50 μL/孔，10 min 内酶联免疫检测仪（6.3）测定结果。 8 结果判断 8.1 8.2 8.3 2 波长 450 nm，先用空白孔校零点，然后读取各孔光密度值。 阴性对照平均 OD 值低于 0.05 作 0.05 计算，高于 0.05 按实际 OD 值计算。 阳性对照 OD 值 ≥ 0.8，实验结果有效。 DB22/T 2984—2019 8.4 样品 OD 值/阴性对照平均 OD 值 ≥ 2 判断为阳性，否则为阴性。 3 DB22/T 2984—2019 附 录 A （规范性附录） 相关试剂的配制 PBS pH7.4 配制见表 A.1。 表A.1 NaCl 8.0 g KH2PO4 1.2 g Na2HPO4•12H2O 2.9 g KCI 0.2 g 蒸馏水 加至 1 000 mL 包被液配制见表 A.2。 表A.2 NaHCO3 2.93 g Na2CO3 1.95 g 蒸馏水 加至1 000 mL pH调至 9.6，4 ℃保存 洗涤液 pH7.4 配制见表 A.3。 表A.3 4 NaCl 8.0 g KH2PO4 1.2 g Na2HPO4•12H2O 2.9 g KCI 0.2 g Tween20 0.5 mL 蒸馏水 加至1 000 mL DB22/T 2984—2019 封闭液配制见表 A.4。 表A.4 兔血清白蛋白 5 g 洗涤液 100mL pH5.0 磷酸盐-柠檬酸缓冲液配制见表 A.5。 表A.5 0.2 mol/L Na2HPO4 25.7 mL 0.1 mol/L 柠檬酸 24.3 mL 蒸馏水 50 mL 底物溶液（OPD-H2O2）配制见表 A.6。 表A.6 pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液 100 mL 邻苯二胺 40 mg 30%H2O2 15mL 终止液配制见表 A.7。 表A.7 浓硫酸 22.2 mL 蒸馏水 177.8 mL B 5 DB22/T 2984—2019 附 录 B （规范性附录） MDV 免疫球蛋白提取 MDV免疫球蛋白提取步骤为： a) 取 20 mL MD 高免血清，加 20 mL pH 7.4 的 PBS，使其稀释 1 倍； b) 在搅拌条件下缓慢加入 40 mL 的饱和硫酸铵（50%饱和度），4 ℃ 放置 0.5 h～ 1 h； c) 以 3 000 r/min 离心 20 min，弃去上清液； d) 加入 20 mL PBS，将沉淀充分溶解后再加入 10 mL 饱和硫酸铵（即 33%饱和度），进行第二次 沉淀； e) 重复 B.4 二次，使沉淀物达到完全白色为止； f) 沉淀物溶于 2 mL～4 mL PBS 中，装入透析袋中密封； g) 再将其放到盛有 PBS 的容器中，于 4 ℃ 条件下透析过夜脱盐； h) 再用 SephadexG-25 进行过柱纯化； i) 收集纯化免疫球蛋白，将其用蔗糖浓缩后采用紫外分光光度计进行蛋白含量测定，IgG 含量为 1.28 mg/mL； j) 进行分装，-20 ℃保存备用。 6 DB22/T 2984—2019 CA 附 录 C （规范性附录） MDV 酶标抗体 MDV酶标抗体的标记步骤为： a) 取 10 mg HRP 溶于 1.0 mL 蒸馏水，加入新鲜配制的 0.06 mol/L 高碘酸钠水溶液 1.0 mL，混 匀后置冰箱 4 ℃ 30 min； b) 将其取出加入 0.16 mol/L 乙二醇水溶液 1.0 mL，于室温放置 30 min 后加入含 10 mg 纯化 MD IgG 水溶液 2.0 mL； c) 将上述结合物混匀后装入透析袋中在 0.05 mol/L pH 9.5 的碳酸缓冲液中缓慢搅拌透析 6 h 使之结合，然后吸出； d) 再将吸出物加 5 mg/mL 硼氢化钠溶液 0.4 mL，4 ℃放置 2 h； e) 将上述结合物混合液加入等体积的饱和硫酸铵，4 ℃放置 30 min 后，以 3 000 r/min 离心 20 min，沉淀物溶于少许 0.02 mol/L pH 7.4 的 PBS 中，透析过夜； f) 再将其在 4℃条件下 1.5×104 r/min 离心 20 min，吸取上清液加入 0.02 mol/L pH 7.4 的 PBS 至 10 mL，测定工作效价，酶标抗体的效价为 1:400 倍，酶结合物的摩尔比为 1.40； g) 使用时 400 倍稀释为 MDV 酶标抗体，-20 ℃保存。 _________________________________ 7