ICS 11.220 B 41 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2972—2019 羊泰勒虫病病原检测 PCR 法 PCR assay for detection of theileria ovis 2019 - 05 - 27 发布 吉林省市场监督管理厅 2019 - 06 - 17 实施 发 布 DB22/T 2972—2019 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：延边大学、吉林农业科技学院、吉林省动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：贾立军、田万年、柴方红、梁晚枫、陈健、王海军、王欣睿、李国峰。 I DB22/T 2972—2019 羊泰勒虫病病原检测 PCR 法 1 范围 本标准规定了羊泰勒虫病病原PCR检测方法原理、试剂和仪器、样品采集、操作步骤和判定结果。 本标准适用于绵羊泰勒虫病病原检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 双链DNA在高温加热的作用下变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则，通 过人工合成的特异性寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链，再利用反应 混合物中的四种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)合成新生的DNA互补链，进而完成特定片段的体外扩增。 4 试剂和仪器 4.1 试剂 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。 4.1.1 血液 DNA 提取试剂盒。 4.1.2 10×PCR 缓冲液。 4.1.3 dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP），浓度 2.5 mmol/L。 4.1.4 Taq DNA 聚合酶，浓度 5 U/μL。 4.1.5 50×TAE 缓冲液见表 A.1。 4.1.6 10 mg/mL 溴化乙锭见表 A.2。 4.1.7 1%琼脂糖凝胶见表 A.3。 4.1.8 加样缓冲液见表 A.4。 4.1.9 阴性对照为健康绵羊血液 DNA 提取物。 4.1.10 阳性对照为羊泰勒虫感染的绵羊血液 DNA 或含有目的片段 DNA 序列，DNA 序列参见附录 B。 4.1.11 空白对照为灭菌双蒸水。 4.1.12 DNA Marker 分子量标准。 4.2 4.2.1 4.2.2 耗材 抗凝管。 吸头（200 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL、2 μL～20 μL、0.5 μL～10 μL）。 1 DB22/T 2972—2019 4.2.3 4.2.4 4.2.5 4.3 Eppendorf 管（1.5 mL、0.5 mL、0.2 mL）。 PCR 反应管。 三角瓶。 引物 引物序列与浓度见表 1。 表1 引物序列与浓度 引物 引物序列 P1（上游引物） 5'-TGATGAGTTGATGTATTGTGGC-3' 长度/bp 671 P2（下游引物） 4.4 浓度/μmol/L 18S rRNA (AY262119) 10 仪器设备 4.4.1 4.4.2 4.4.3 4.4.4 4.4.5 4.4.6 4.4.7 4.4.8 4.4.9 5 5'-TACCCGCATCCTATTTAGCAG-3' 基因序列 微量加样器，单道 2 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL 和 1000 μL。 低温高速离心机，12 000 r/min 以上。 PCR 扩增仪，温度范围为 4 ℃～100 ℃。 分析天平，感量 0.1 mg。 高压灭菌器，120 ℃ 以上。 微波炉或恒温水浴锅，室温～100 ℃。 水平电泳槽。 电泳仪，电压 1 V～300 V，电流 1 mA～400 mA。 凝胶成像系统或紫外灯。 样品采集 用抗凝管（4.2.1）无菌采集待检绵羊血液样品5 mL，编号。冷藏条件下送实验室检测。 6 操作步骤 6.1 样品 DNA 制备 按照血液DNA提取试剂盒（4.1.1）操作说明书，提取待检绵羊血液样品基因组DNA、阴性对照（4.1.9） 样品基因组DNA和阳性对照（4.1.10）样品基因组DNA。 6.2 PCR 检测 在PCR反应管（4.2.4）中依次加入反应试剂，PCR扩增体系为25 µL，见表2。混匀后置PCR扩增仪 （4.4.3）中，反应条件为 96 ℃预变性5 min，94 ℃变性 1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min， 进行35个循环，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃ 保存。同时设定阴性对照、阳性对照和空白对照。 2 DB22/T 2972—2019 表2 PCR 检测反应体系 试剂 体积 10×PCR 缓冲液 2.5 µL 2.5 mmol/L dNTP 2.0 µL 10 µmol/L 上游引物 1.0 µL 10 µmol/L 下游引物 1.0 µL 5 U/µL Taq 酶 0.25 µL 25 mg/L 样品 DNA 2.0 µL 灭菌双蒸水 16.25 µL 总体积 25 µL 6.3 PCR 产物电泳 将1%琼脂糖凝胶（4.1.7）板置于1×TAE缓冲液的电泳槽（4.4.7）中，取加样缓冲液（4.1.8）5 µL 分别与 5 µL 的待检绵羊血液基因组DNA样品、阴性对照（4.1.9）、阳性对照（4.1.10）和空白对照 （4.1.11）的PCR产物混匀后，按编号加入到1%琼脂糖凝胶板的加样孔中，凝胶的边孔中加入标准分子 量DNA Marker（4.1.12）。在 150 V 恒定电压下电泳仪（4.4.8）电泳30 min后，凝胶成像系统（4.4.9） 观察结果。 7 7.1 结果判定 条件 标准阳性对照出现 671 bp 的DNA扩增条带，标准阴性对照和空白对照无此扩增条带，反应结果成 立。参见附录C。 7.2 结果 在阴性对照、阳性对照和空白对照成立条件下，若待检样品出现 671 bp 的DNA扩增条带，判为阳 性，报告绵羊泰勒虫感染。若无此DNA扩增条带，判为阴性，报告绵羊泰勒虫未感染。 3 DB22/T 2972—2019 AA 附 录 A （规范性附录） 聚合酶链式反应（PCR）试验常用试剂配制 A.1 50×TAE缓冲液 A.1.1 0.5 mol/L乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0）的配制见表 A.1。 表A.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸（EDTA）（pH 8.0） 乙二铵四乙酸二钠 18.6 g 灭菌双蒸水 80 mL 氢氧化钠 调 pH 至 8.0 灭菌双蒸水 A.1.2 定容至 100 mL TAE缓冲液（50×）的配制见表 A.2。 表A.2 TAE 缓冲液（50×）配制 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 冰乙酸 242 g 57.1 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸（EDTA） （pH 8.0） 10 mL 注：加去离子水定容至100 mL，室温保存备用，使用时稀释 50×为工作液。 A.2 10 mg/mL溴化乙锭 10 mg/mL溴化乙锭的的配制见表 A.3。 表A.3 A.3 A.3.1 4 10 mg/mL 溴化乙锭 溴化乙锭 0.1 g 水（H2O） 定容至 10 mL 1%琼脂糖凝胶 1%琼脂糖凝胶的制备见表 A.4。 DB22/T 2972—2019 表A.4 1%琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖 1 g 1×TAE 缓冲液 定容至 100 mL A.3.2 将三角瓶（4.2.5）放在沸水浴或微波炉（4.4.5）中加热至琼脂糖充分溶解（注意用微波炉加 热时不要沸出），置室温冷却到50 ℃左右，加入10 mg/mL溴化乙锭10 μL，摇匀，倒入电泳板上，凝固 后，4 ℃ 备用。 A.4 加样缓冲液 加样缓冲液的配制见表A.5。 表A.5 加样缓冲液 溴酚蓝 10 mg 甘油 2.5 mL 0.5 mol/L pH 6.8 三羟甲基氨基甲烷-盐酸 定容至 10 mL （Tris-HCl）缓冲液 5 DB22/T 2972—2019 BB 附 录 B （资料性附录） M 羊泰勒虫18S rRNA基因片段671 bp的DNA序列。 TGATGAGTTGATGTATTGTGGCTTATTTCGGATGATACTTGTATTATCCGGATGATTACTT TGAGAAAATTAGAGTGCTCAAAGCAGGCTTTTGCCTTGAATAGTTTAGCATGGAATAATAA AGTAGGACTTTGGTTCTATTTTGTTGGTTTTAGGTACCAAAGTAATGGTTAATAGGAACAGT TGGGGGCATTCGTATTTAACTGTCAGAGGTGAAATTCTTAGATTTGTTAAAGACGAACTACT GCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGAC GATCAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGACTAGAGATTGGAGGTCGTCAG TTTTTACGACTCCTTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATG GTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCG GCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAAGGAAGGATTGACAGA TTGATAGCTCTTTCTTGATTCTTTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGA TTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGGATGCGGGTA 说明： 横线部分为目的片段PCR扩增上游引物序列，以及下游引物的互补序列。 6 DB22/T 2972—2019 CC 附 录 C （资料性附录） N PCR扩增产物电泳图见图 C.1。 M 1 2 3 2000 bp1000 bp750 bp500 bp200 bp- -671 bp 说明： M——DL 2000 DNA Marker；