ICS 65.020 B 04 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 3293—2018 农田杂草反枝苋对草甘膦抗性检测 技术规程 Code of practice for detection of glyphosate-resistant redroot pigweed (Amaranthus retroflexus L.) in cropland 文稿版次选择 2018 - 12 - 29 发布 安徽省市场监督管理局 2019 - 01 - 29 实施 发 布 DB34/T 3293—2018 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省农业科学院棉花研究所提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽省农业科学院棉花研究所、中国农业科学院棉花研究所、岳西县农业技术综 合服务中心、六安市植物检疫植物保护站、来安县农业技术推广中心、太湖县种植业管理局、宣城市种 植业管理局、黄山市农业科学研究所、安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所。 本标准主要起草人：李淑英、路献勇、马艳、马小艳、阚画春、程福如、陈敏、刘小玲、郑曙峰、 程森林、王维、徐道青、石扬娟、祁静星、胡俊斌、胡锋、吴明奎、胡本进。 I DB34/T 3293—2018 农田杂草反枝苋对草甘膦抗性检测技术规程 1 范围 本标准规定了农田杂草反枝苋（Amaranthus retroflexus L.）对除草剂草甘膦抗性检测试剂与溶 液、仪器和设备、生物试材、试验步骤、数据统计与分析与抗药性水平的评价。 本标准适用于反枝苋对除草剂草甘膦抗性的检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 胚根长度 Length of radicel 从与种子连接处到胚根顶端。 2.2 胚轴长度 Length of hypocotyl 从与种子连接处到胚轴顶端。 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4 4.1 4.2 4.3 4.4 试剂与溶液 草甘膦原药。 莽草酸（Shikimic Acid；3,4,5-三羟基-1-环己烯-1-羧酸；99％纯度）。 10％ Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）。 0.1％ Triton X-100。 0.3％高锰酸钾（KMnO4）。 0.25 mol/L 盐酸。 1 mol/L 氢氧化钠。 0.1 mol/L 甘氨酸（C2H5NO2）。 0.1％高碘酸（HIO4·2H2O）。 仪器和设备 培养皿（内径 9 cm）。 盆钵。 移液器（20 µL、100 µL、200 µL、1000 µL 和 5000 µL）。 可控定量喷雾设备。 1 DB34/T 3293—2018 4.5 紫外可见光分光光度计。 4.6 离心管（1.5 mL，2 mL，10 mL）。 4.7 超高速离心机。 4.8 光照培养箱。 4.9 人工气候箱：可设定温度为白天 30℃黑夜 25℃、相对湿度（RH）60 ± 10％、光照周期 12 h: 12 h（L: D）。 5 生物试材 5.1 试验土壤 采集有机质含量≤3 g/kg、pH 6.0～6.5 或 6.5～7.0 壤土粉碎风干后备用，试验前在 120℃干燥 箱内烘 6 h（灭活土壤内杂草种子）。 5.2 杂草种子 采集各试验样点成熟的反枝苋种子。种子的田间采集区域不小于 100 m×50 m，每隔 20 km 取样 1 次，然后将每个地区或县域内所取样本混合。同时在没有施用过草甘膦地区采集反枝苋种子，作为敏感 对照。 杂草种子 4℃低温冰箱中保存。 6 试验步骤 6.1 杂草种子处理 首先将供试反枝苋种子用质量分数为 0.3％的高锰酸钾溶液浸泡消毒 10 min，用无菌水清洗 3 次。然后在 9 cm 培养皿内放 2 层滤纸，每皿放入 50 粒反枝苋种子，置于光照培养箱内催芽，培养 周期和温度设为白天 30℃12 h、黑夜 25℃12 h，当种子露白时待用。 6.2 反枝苋幼苗处理 试验土壤定量装至盆钵的 4/5 处。采用盆钵底部渗灌方式，使土壤完全湿润。将预处理的供试反 枝苋种子均匀撒播于土壤表面，覆土 0.5～1.0 cm 左右，播种后移入人工气候箱常规培养。以盆钵底 部渗灌方式补水。杂草出苗后进行间苗，当反枝苋长至 3～4 叶期时定苗，每钵保留长势一致的 10 棵 幼苗。 6.3 药液配制 6.3.1 6.3.1.1 Triton X-100 系列溶液配置 30％ Triton X-100 量取 30 mL Triton X-100，加水定容到 100 mL。 6.3.1.2 10％ Triton X-100 量取 33.33 mL 30％ Triton X-100，加水定容至 100 mL。 6.3.1.3 2 0.1％ Triton X-100 DB34/T 3293—2018 量取 1 mL 10％ Triton X-100，加水定容到 100 mL。 6.3.2 草甘膦母液配置 准确称取一定量的草甘膦原药，用丙酮溶解，并加入 10％ Triton X-100，配制成母液备用。 6.4 测定方法 测定方法可选择附录A、附录B、附录C 中的任一种，以附录B 中整株植物测定法为宜。 6.5 结果调查 根据不同测定方法，选择如下结果调查方法： ——培养皿测定法：在草甘膦处理后 7 d 测量反枝苋胚根和胚轴的长度。 ——整株植物测定法：在施药后 8 d，记录每个剂量处理的反枝苋药害症状与级别（见表 1），然 后剪取地上部分称量鲜重，再放入干燥箱内，经 70℃48 h 烘干后称取干重。 ——莽草酸测定法：根据吸光值，结合莽草酸的标准曲线，计算出不同浓度药剂处理后反枝苋体内 莽草酸的累积量。 表1 草甘膦对反枝苋毒害症状分级标准 级 别 7 7.1 反枝苋药害症状 0 无症状。 1 叶片轻微萎蔫。 2 心叶出现萎蔫现象，叶片开始黄化卷曲，部分叶片出现枯斑，枯叶面积为 20％～40％。 3 呈现黄色或褐色，枯叶面积为 40％～70％，植株生长受到抑制，萎缩趋势明显。 4 叶片畸形卷曲，植株叶片整体褪色枯萎，枯叶面积达到 70％以上，植株明显萎蔫，生长停滞。 5 植株萎缩干枯，枯死面积达到 95％以上，或整株死亡。 数据统计与分析 除草剂抑制效果计算方法 根据培养皿测定法调查数据，按式（1）计算各药剂处理的胚根长或胚轴长占空白对照的生长百分 率（％），计算结果保留小数点后两位。 L1 RL＝ ×100％ ...................................... (1) L0 式中： RL ——生长百分率（％）； L0 ——对照反枝苋胚根长（或胚轴长）（mm）； L1 ——处理反枝苋胚根长（或胚轴长）（mm）。 根据整株植物测定法调查数据，利用式（2）计算施药后反枝苋的药害反应的药害综合指数 I（％）。 i 为杂草药害等级。 ∑（Ni×i） ×100％ .................................. (2) N×imax I＝ 式中： Ni ——每钵各毒害级别杂草株数； 3 DB34/T 3293—2018 i ——毒害级别； N ——每钵总杂草株数； imax ——每钵最高毒害级别。 根据调查数据，利用式（3）计算各药剂处理反枝苋的干重占空白对照的干重百分率。 R G＝ G1 ×100％ ..................................... (3) G0 式中： RG ——生长百分率（％）； G0 ——对照反枝苋干重（g）； G1 ——各处理反枝苋干重（g）。 7.2 回归方程和抑制中浓度计算方法 用 DPS（数据处理系统）、SAS（统计分析系统）或 SPSS（社会科学统计程序）标准统计软件按式 （4）对药剂浓度与生长百分率 RL、药害综合指数 I 或干重百分率 RG 进行非线性回归分析，计算 ED50、 ED90 值及 95％置信限。 D—C .............................. (4) x b 1＋( ) ED50 RL（或I、RG）＝C＋ 式中： RL ——生长百分率； RG ——干重百分率； I ——药害综合指数； x ——草甘膦浓度(mg/L)； C ——高浓度草甘膦处理下杂草生长百分率； D ——低浓度草甘膦处理下杂草生长百分率； ED50 ——对杂草生长起到 50％抑制作用的草甘膦浓度(mg/L)； b ——ED50 处的曲线斜率。 用 DPS（数据处理系统）、SAS（统计分析系统）或 SPSS（社会科学统计程序）标准统计软件按式 （5）对药剂浓度与莽草酸积累量进行非线性回归分析，计算 ED50、ED90 值及 95％置信限。 C—D 1＋exp(b×(logx—logED50)) U＝D＋ ........................... (5) 式中： U ——草甘膦处理后莽草酸积累量； x ——草甘膦浓度(mg/L)； D ——当草甘膦浓度为 0 时莽草酸积累量； C ——当草甘膦在极高浓度是莽草酸积累量； ED50 ——当莽草酸积累量达 C 与 D 之间的 50％时的草甘膦浓度(mg/L)； b ——曲线在 ED50 处的斜率。 8 抗药性水平评价 8.1 4 抗性倍数的计算 DB34/T 3293—2018 根据敏感杂草生物型的 ED50 值和测试杂草生物型的 ED50 值，按式（6）计算测试种群的抗性倍数。 T RR＝ ......................................... (6) S 式中： RR ——测试杂草生物型的抗性倍数； T ——测试杂草生物型的 ED50 值； S ——敏感杂草生物型的 ED50 值。 8.2 抗药性水平的评价 根据抗性倍数的计算结果，按照表2中抗药性水平的分级标准，对测试杂草生物型的抗药性水平作 出评估。 表2 抗药性水平分级 抗药性水平的分级标准 抗性倍数 （倍） 低水平抗性 5.0 ＜ RR ≤ 10.0 中等水平抗性 10.0 ＜ RR ≤ 50.0 高水平抗性 RR ＞ 50.0 5 DB34/T 3293—2018 AA 附 录 A （规范性附录） 培养皿测定法 A.1 将草甘膦母液用 0.1％ Triton X-100 水溶液按照等比梯度配制成 5～7 个系列浓度（0～320 m g/L）；每处理设 6 次重复，并设不含药剂的 Triton 水溶液作空白对照。 A.2 选 20 粒经预处