ICS 59.080 W 59 DB21 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 3084—2018 羽绒制品中鹅绒的鉴别 PCR 法和实时荧光 PCR 法 Identification of Goose Down Fiber in Feather and Down Products -PCR method and real-time fluorescence PCR method 2018 - 12 - 25 发布 辽宁省市场监督管理局 2019 - 01 - 25 实施 发 布 DB21/T 3084—2018 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写》给出的规则编制。 本标准附录 A、附录 B 为资料性附录。 本标准由中华人民共和国大连海关提出并归口。 本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局检验检疫技术中心。 本标准主要起草人：任亮、颜怀玉、孔平、王贵滨、肇慧君。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 I DB21/T 3084—2018 羽绒制品中鹅绒的鉴别 PCR 法和实时荧光 PCR 法 1 范围 本标准规定了羽绒制品中鹅绒的 PCR 和实时荧光 PCR 鉴别方法。 本标准适用于羽绒制品。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 3.1 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction 一种模拟天然 DNA 复制的体外扩增法，在 DNA 聚合酶催化下，以母链 DNA 为模板，以特定引物 为延伸起点，以 4 种单核苷酸（dNTP）为底物，通过变性—退火—延伸的循环反应，使极少量的 DNA 的特定片段，在短短几小时内扩增上百万倍。 3.2 实时荧光 PCR real-time fluorescence polymerase chain reaction 在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过曲线对未 知模板进行定量或定性分析的方法。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（base pair） Ct 值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（cycle threshold） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid） DTT：二硫疏糖醇 dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate） 5 原理 用试剂盒法或其他等效 DNA 提取法提取样品中的 DNA。针对鹅的线粒体 DNA 序列设计引物和探 针，通过单 PCR、实时荧光 PCR 技术，对 DNA 中的鹅成分分别进行特异性扩增，根据实验结果，判 定样品中是否含有鹅绒。 1 DB21/T 3084—2018 6 试剂 6.1 实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 6.2 组织和毛发提取试剂盒 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0(TaKaRa Code.9765)。参见附录 A 中 A.1。 6.3 Premix Ex Taq™ (Probe qPCR) (TaKaRa Code. RR390A) 参见附录 A 中 A.2。 6.4 100%乙醇。 6.5 溴化乙锭溶液。 6.6 DNA Laddar Marker。 7 设备与器具 7.1 PCR 仪 7.2 实时荧光定量 PCR 仪 7.3 电泳装置 7.4 凝胶成像仪 7.5 冰箱：4 ℃~20 ℃ 7.6 天平：精度为 0.0001 g 7.7 分析研磨机 7.8 微孔干浴器或水浴锅 7.9 瞬时离心机 7.10 涡旋混合器 7.11 1.5 mL 磁分离架 7.12 微量可调移液器：0.1μL~2.5 µL，1 µL ~10 µL，2 µL ~20 µL，10 µL ~100 µL，20 µL ~200 µL， 100 µL ~1000 µL。 7.13 1.5 mL 离心管，2.0 mL 离心管 7.14 PCR 薄壁管 7.15 实时荧光 PCR 光学反应管 7.16 超净工作台 8 取样 从羽绒服或其他羽绒制品的不同部位取样，混合均匀后，再取约 1 g 试样。 9 制样 将样品剪碎，经分析研磨机打散混匀，再次尽量剪碎至 2 mm 以下，再次用分析研磨机混匀。 10 DNA 的提取 10.1 组织裂解 2 DB21/T 3084—2018 称取约 5 mg 试样，放入 2 mL 离心管中，每个样平行提取 2 管，加入 180 µL 的缓冲液 GL（Buffer GL）、20 µL 的蛋白酶 K（Proteinase K）和 10 µL 的核糖核酸酶 A（RNase A，10 mg/mL），于 56 ℃ 水浴温浴至组织完全裂解 3 小时。如残存纤维状组织无法完全裂解，裂解之后先 12,000 rpm 离心 2 分 钟，去除杂质之后再进行后续操作。向裂解液中加入 200 µL 缓冲液 GB（Buffer GB）和 200 µL 100% 乙醇，充分吸打混匀。 注：温浴时可时常将样品取出进行振荡或吸打以加速裂解。 10.2 将核酸纯化柱（Spin Column）安置于收集管（Collection Tube）上，溶液移至核酸纯化柱中，12,000 rpm 离心 2 分钟，弃滤液。 10.3 将 500 µL 的缓冲液 WA（Buffer WA）加入至核酸纯化柱中，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液。 10.4 将 700 µL 的缓冲液 WB 加入至核酸纯化柱中，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液。 10.5 确认缓冲液 WB 中已经加入了指定体积的 100%乙醇。 10.6 沿核酸纯化柱管壁四周加入缓冲液 WB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。 10.7 重复操作步骤 4。 10.8 将核酸纯化柱安置于收集管上，12,000 rpm 离心 2 分钟。 10.9 将核酸纯化柱安置于新的 1.5 mL 的离心管上，在核酸纯化柱膜的中央处加入 50 µL ~200 µL 的 灭菌水或洗脱液（Elution Buffer），室温静置 5 分钟。 10.10 将灭菌蒸馏水或洗脱液加热至 65 ℃使用时有利于提高洗脱效率。 10.11 12, 000 rpm 离心 2 分钟洗脱 DNA。如需获得更大收量，可将离下液重新加入到核酸纯化柱膜的 中央或再加入 50 L~200 µL 的灭菌水或洗脱液，室温静置 5 分钟后，12,000 rpm 离心 2 分钟洗脱 DNA。 11 DNA 的鉴别 11.1 质量控制 进行 PCR、实时荧光 PCR 鉴别时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照：扩增鹅成分时 用鹅绒 DNA。阴性对照：扩增鹅成分时用非鹅绒 DNA，空白对照：实验用水。 11.2 PCR 法 11.2.1 引物 所用引物信息见表1。 表1 PCR 扩增所用引物 扩增成分 鹅 引物名称 引物序列 退火温度/℃ 产物大小/bp Goose-cytb-F 5’- GCTACTAGCCATACACTAC -3’ 60.3 375 Goose-cytb-R 5’- GTTGGATTGTCTACTGAGA -3’ 60.0 375 11.2.2 PCR 反应体系 premix Ex Taq (2×) 12.5 µL，10 µmol/L 引物各 1 µL，DNA 模板 2 µL，ddH2O 8.5 µL 11.2.3 反应条件 95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，退火温度（见表 1） ，60 ℃，30 s，40 个循环。 注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。 3 DB21/T 3084—2018 11.2.4 PCR 产物的检测 将适量 5×TBE 稀释成 0.5×TBE 溶液，配制 2.0% 琼脂糖凝胶，取 15 µL PCR 产物，点样进行电泳， 并加 DNA marker 点样以判断 PCR 产物的片段大小。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在 3 V/cm~5 V/cm 长度，电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定。电泳结束后，将凝胶置溴化乙锭溶液（10 µg/µL）中浸泡 30 min。用凝胶成像系统观察、拍照、记录与分析电泳结果。 11.2.5 PCR 结果及判断 阳性对照出现预期大小的扩增条带，阴性对照和空白对照均未出现条带；待测样品未出现预期大小 的扩增条带，判断结果为阴性。待测样品出现预期大小的扩增条带，判断结果为可疑阳性，需进一 步确证。 11.2.6 结果确证实验 可疑阳性结果的采用实时荧光 PCR 法进行确证。 11.3 实时荧光 PCR 法 11.3.1 引物及探针 所用的引物、探针见表 2。 表2 实时荧光 PCR 所用引物、探针 扩增成分 鹅 引物名称 引物序列 退火温度/℃ 产物大小/bp Goose-cytb-F 5’- GCTACTAGCCATACACTAC -3’ 60.3 375 Goose-cytb-R 5’- GTTGGATTGTCTACTGAGA -3’ 60.0 375 Goose-cytb-P 5’-（ FAM）CGCAGACACTTCACTCGCCT（Eclipse） -3’ 70.0 375 11.3.2 PCR 反应体系 Premix Ex Taq (2×) 12.5 µL，Premix Ex Taq (2×) 12.5 µL，Primer F (10 µM) 1 µL，Primer R (10 µM) 1 µL ，Probe (5 µM) 1 µL，DNA×2 µL，dH2O7.5 µL，× Negative control 反应时，加入 RNase free dH2O，× Positive 反应时，做 2 个平行样。 11.3.3 PCR 反应条件 95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，退火温度（见表 2） ，60 ℃，30 s，40 个循环。 注：不同仪器可根据仪器要求和 Premix Ex TaqTM 使用说明书将反应参数作适当调整。 11.3.4 结果分析 反应结束后，应设置无效基线范围，基线范围选择在 3~15 个循环，如果有强阳性样本，应根据实 际情况调整基线范围。阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且 Ct 值=40