ICS 65.020 B 38 云 南 省 地 方 标 准 DB53/T 903—2019 金钗石斛组培育苗技术规程 2019 - 03 - 01 发布 云南省市场监督管理局 2019 - 06 - 01 实施 发 布 DB53/T 903—2019 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由云南省德宏热带农业科学研究所提出。 本标准由云南省农业标准化技术委员会（YNTC07）归口。 本标准起草单位：云南省德宏热带农业科学研究所。 本标准主要起草人：高燕、白燕冰、李泽生、李桂琳、姜艳、罗凯、周侯光、姚春、李薇莎。 I DB53/T 903—2019 金钗石斛组培育苗技术规程 1 范围 本标准规定了金钗石斛 （Dendrobium nobile Lindl.）组培育苗的组培苗生产条件、培养基配制、 外植体选择及处理、接种及瓶苗生产、假植苗培育、包装、标志与运输等要求。 本标准适用于金钗石斛组培苗工厂化生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 DB53/T 623-2014 “魔帝”系及“肉饼”系兜兰盆花生产技术规程 3 组培苗生产条件 3.1 组培室 组培室必须配备灭菌室、储藏室、接种室、培养室等组培生产的基本条件。灭菌室用于接种工具和 培养基消毒；储藏室用于灭菌好的培养基储藏；接种室用于接种材料消毒、接种、容器苗转接；培养室 用于容器苗培养。 3.2 设备 组培育苗设备有高压灭菌锅、超净工作台、电热消毒器，冰箱、电子天平（精度0.000 1）、电子 称（精度0.01）、空调、臭氧发生器、除湿机等。 玻璃器皿：量筒、容量瓶、烧杯、培养瓶等。 3.3 试剂 培养基组成试剂包括：硝酸钾、硝酸铵、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、无水氯化钙、七水硫酸亚铁、 乙二胺四乙酸二钠、一水硫酸锰、七水硫酸锌、硼酸、碘化钾、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、甘氨酸、盐 酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇。 外植体消毒试剂包括：次氯酸钠、酒精、消毒液等。 酸碱调节试剂包括：盐酸、氢氧化钠。 3.4 添加物 添加物包括马铃薯和香蕉。 4 培养基配制 4.1 培养基组成 1 DB53/T 903—2019 培养基为改良的MS（Murashige和Skoog，1962）基本培养基，具体配方参见附录A。 4.2 母液配制 母液用蒸馏水或超纯水配制，配制方法见附录A。大量元素母液室温密封保存，铁盐、微量元素、 有机附加物母液置于4 ℃保存，植物生长调节剂避光保存于4 ℃条件下。母液如有沉淀或有微生物和藻 类生长，应废弃不用。 4.3 培养基配制 培养基配制要求如下： a)根据所需培养基配方用量，按比例吸取母液放入烧杯，按附录A称取琼脂粉和蔗糖用纯净水加热 充分溶解，有机添加物要去皮打浆，加入至容器内用纯净水定容后，搅拌均匀。 b)用1.0 mol/L盐酸或1.0 mol/L氢氧化钠调整培养基酸碱度值为pH 5.8。 c)培养基要趁热分装到培养器皿内，及时密封。 4.4 培养基及蒴果消毒 4.4.1 培养基消毒 培养基消毒要求如下： a)将分装并密封好的培养基放入高压消毒锅内消毒。 b)加热至0.11 MPa压力下，温度121 ℃下，灭菌20 min。 c)关闭电源，自然冷却至压力表指针降至0 时，开锅取出培养基。 4.4.2 蒴果消毒 流水冲洗20 min～30 min,用0.1 %的洗洁精或洗衣粉溶液漂洗，用自来水冲洗干净，纯净水冲洗2 次～3 次，置于玻璃瓶中备用。在超净工作台上用75 %的酒精浸泡消毒60 s～80 s，放入10％次氯酸钠 溶液中轻轻摇动，消毒15 min～20 min，用无菌水清洗5 次～6 次，用无菌滤纸吸干蒴果表面水分，或 用酒精灯烘烤蒴果表面至干燥。 4.5 培养基储藏 经过灭菌的培养基，及时转运至储藏室储藏，放置3 d后，无污染培养基在7 d内使用完毕。 5 外植体选择及处理 5.1 外植体选择 选择优质高产、抗性强、农艺性状优良、生长健壮、无病虫害、无机械损伤的母株,采集成熟未开 裂的蒴果。 5.2 采集时间 10 月～11 月选择晴天的早上露水干后采集蒴果。采集的蒴果加标签，标明母株编号、采集地点、 采集时间等。蒴果若要长途运输或储藏，宜用保湿材料包扎。未用的蒴果应放入密封容器中置于4 ℃保 存，保存时间不应超过30 d。 2 DB53/T 903—2019 6 接种及瓶苗生产 6.1 接种前准备 6.1.1 接种前，接种人员用洗洁剂洗手，然后换鞋、工作服、带上口罩、帽子方可进接种室。 6.1.2 开启超净工作台紫外灯杀菌 20 min～30 min。接种时，关闭紫外灯，开启风机，同时开启电热 消毒器，并加热至（300±2）℃。 6.1.3 接种工具、器皿、纸经高温灭菌，镊子、刀片、支架也可用酒精灯灼烧消毒。 6.1.4 超净工作台使用前，用 75％酒精擦台面和玻璃挡板，照明灯、紫外灯及超净工作台每星期用消 毒液擦洗一次。 6.1.5 母瓶和培养基容器用 75％酒精擦净表面后放入超净工作台。 6.2 瓶苗生产 6.2.1 培养条件 培养室温度为22 ℃～28 ℃，光照强度为1600 Lx～2200 Lx，每天光照时间为8 h～12 h。 6.2.2 种子萌发培养 将消毒好的蒴果置于无菌的过滤纸或接种器皿中，切开蒴果，将种子均匀播撒于萌发培养基表面， 培养50 d后，形成原球茎。 6.2.3 增殖培养 将获得的原球茎均匀接种到增殖分化培养基上，培养60 d后，形成分化苗。 6.2.4 继代培养 将获得的分化苗分割，单芽接种到继代培养基上，培养60 d后，形成继代苗。 6.2.5 壮苗生根培养 将获得的继代苗分割单芽，单芽株高＜2 cm接入继代培养基中培养，单芽株高＞2 cm 接入壮苗生 根培养基中培养，接种标准：650 mL组培瓶每瓶接种18株～20株，240 mL组培瓶每瓶接种10株～12株， 培养50 d～70 d后即可炼苗。 6.2.6 瓶苗炼苗 将株高4 cm以上的生根瓶苗置于遮光率为 85％，温度25 ℃～30 ℃的温室或荫棚下炼苗20 d～30d。 6.2.7 瓶苗质量分级 在符合综合控制指标要求的前提下，合格生根瓶苗以苗高、茎粗、根数指标确定，质量等级分为Ⅰ 级、Ⅱ级分级标准见表1 。 7 7.1 假植苗培育 基质 假植苗基质应选用沥水、透气性好的基质，如刨花、锯木渣等，用杀菌剂消毒处理。 3 DB53/T 903—2019 表1 金钗石斛组培瓶苗质量分级表 苗木等级 Ⅰ级苗 种类 Ⅱ级苗 茎粗 cm 苗高 cm 根数 ﹥ ﹥ ﹥ 茎粗 cm 苗高 cm 综合控制指标 根数 1.来自品种纯正，纯度 100%； 2.叶色浓绿舒展，叶片无坏死斑， 生根瓶苗 2.5 5.0 5 1.5～2.5 3.0～5.0 2～5 无畸形叶； 3.无污染、无烂茎、无烂根； 4.根系生长良好，分布均匀，舒展 不卷曲。 7.2 育苗大棚 用遮光率85％的遮荫网搭建育苗大棚，离地苗床高60 cm～80 cm，宽100 cm～120 cm，长以地形而 定，苗床之间距离50 cm。 7.3 假植时间 全年均可进行瓶苗假植，以10月至翌年5月为瓶苗最佳假植时间。 7.4 瓶苗处理 将瓶中的幼苗小心取出，洗净附着在根上的培养基，放入50％多菌灵可湿性粉剂1 000倍液中浸泡5 min～10 min，捞出放入透气的容器内，均匀摊开，置阴凉通风处晾干。 7.5 假植 假植前5 d～7 d，将基质平铺于苗床上，厚度6 cm～8 cm，用0.1%高锰酸钾或50％多菌灵可湿性粉 剂1 000倍液等消毒处理。按3株/丛，株行距5 cm×5 cm假植，根不能裸露在基质表面，假植后浇透定 根水。从出瓶到假植完毕，不应超过3 d。 7.6 假植苗管理 7.6.1 光照管理 采用遮光率为85％的遮阳网，注意通风换气。 7.6.2 温度管理 适宜生长温度为20 ℃～28 ℃，温度＞32 ℃时，要注意降温；温度＜10 ℃时，采取保温措施。 7.6.3 水分管理 假植后，每天早晚各浇水 1 次，幼苗成活后，保持基质湿润。 7.6.4 施肥管理 假植 7 d～10 d，用氮磷钾平衡肥料稀释成 3 000 倍液进行叶面喷施，15 d 施一次。 7.6.5 4 病虫害防治 DB53/T 903—2019 假植苗采用75％百菌清600 倍液或65％代森锰锌500倍液交替使用，每月喷药1 次～2 次；出现病 害时，连续喷2次～3次，时间间隔为5 d。 7.6.6 出圃 假植苗培育90 d～120 d，抽新芽苗高4 cm以上，即可出圃。 8 包装、标志与运输 8.1 运输前处理 假植苗出圃前1 d～2 d不浇水，小心拔出生根苗，每捆10丛包装，每丛不少于3株。 8.2 包装 瓶苗或假植苗包装方法参照DB53/T 623-2014规程执行。 8.3 标志 在包装箱上加贴标签，注明品种名称、等级规格、数量、执行标准号、生产单位、商标。 8.4 运输 瓶苗或假植苗包装完毕后，紧密排列在运输箱或纸箱内，分层放置，避免倒置和挤压，长途运输过 程中的温度宜为20 ℃～28 ℃，最高温不宜超过32 ℃，湿度保持在60％～70％。假植苗应存放在阴凉、 通风的环境，运到目的地后及时移栽，宜在3 d内移栽完。 5 DB53/T 903—2019 附 录 A （资料性附录） 金钗石斛组织培养培养基配方 表A.1给出了金钗石斛组织培养培养基配方。 A.1 药品类别 药品名称 KNO3 大量元素 铁盐 微量元素 植物生长调节剂 种子萌发培养基 增殖培养基 继代培养基 壮苗生根培养基 mg/L mg/L mg/L mg/L 1 140 1 425 1 900 950 NH4NO3 990 1 237.5 1 650 825 MgSO4·7H2O 222 277.5 370 185 KH2PO4 102 127.5 170 85 CaCl2 132 165 220 110 FeSO4·7H2O 27.8 27.8 27.8 27.8 Na2-EDTA 37.3 37.3 37.3 37.3 MnSO4·4H2O 17.8 17.8