ICS 65.020.30 B 44 备案号：61243-2019 内 蒙 DB15 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1531—2018 反刍动物瘤胃上皮通透性测定 Ussing chamber 法 Determination of ruminal epithelium permeability in ruminants-ussing chamber Method 2018-12-20 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2019-03-20 实施 发布 DB15/T 1531—2018 前 言 本标准按GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由内蒙古自治区农牧业科学院提出。 本标准由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。 本标准起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古农业大学。 本标准主要起草人：胡红莲、高民、杨淑青、程萌、孙燕勇、宋利文、王丽芳、王梦雅、李洋、羿 静。 I DB15/T 1531—2018 反刍动物瘤胃上皮通透性测定 Ussing chamber 法 1 范围 本标准规定了反刍动物瘤胃上皮通透性的术语和定义、测定方法。 本标准适用于牛、羊等反刍动物瘤胃上皮通透性的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 反刍动物 ruminants 有反刍这种消化方式的一类哺乳动物，这类动物具有复杂的瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃，如牛、羊、 骆驼、鹿等。 3.2 上皮通透性 epithelium permeability 上皮被某些大分子物质（相对分子量＞150道尔顿）以非载体或通道介导的被动扩散方式通过的特 + 性，不包括对离子（如Na 、Cl ）的渗透。 3.3 跨膜电位差 potential different，PD 2 上皮组织的表皮层与基底膜层之间的电位差，单位为mV/cm ×h，用于反映上皮组织的活性。 3.4 短路电流 short-circuit current，Isc 2 在单位时间内穿过上皮并使得跨上皮电压降为零的电流，单位为Ma/cm ×h，用于反映上皮离子的 转运能力，Isc增加表明离子通过上皮的转运能力增强。 3.5 组织导电性 tissue conductance，Gt 2 跨膜电位与Isc的比值，单位为mS/cm ×h，用于反映上皮组织对离子的通透性，Gt增强表明上皮完 整性受损，上皮通透性增加。 4 试剂 4.1 如无特别说明，所用试剂均为分析纯，水应符合 GB/T 6682 的规定。 1 DB15/T 1531—2018 4.2 琼脂糖。 4.3 缓冲溶液 4.3.1 组成 80.0 mmol/L NaCl,5.0 mmol/L KCl ,0.4 mmol/L NaH2PO4·H2O, 2.4 mmol/L Na2HPO4·2H2O, 10.0 mmol/L C3H5NaO2, 25.0 mmol/L C2H3NaO2·3H2O, 5.0 mmol/L C4H7NaO2, 1.2 mmol/L MgCl2·6H2O, 1.2 mmol/L CaCl2·2H2O, 25.0 mmol/L NaHCO3。 4.3.2 配置 准确称取NaCl 4.6800 g、KCl 0.3725 g、NaH2PO4·H2O 0.0552 g、Na2HPO4·2H2O 0.4272 g、C3H5NaO2 0.9600 g、C2H3NaO2·3H2O 3.400 g、C4H7NaO2 0.5500 g、MgCl2·6H2O 0.2436 g、CaCl2·2H2O 0.1764 g和NaHCO3 2.1000 g 放入1000ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。调整溶液pH为7.4（溶液pH﹥7.4,用HCl调整；溶液pH ﹤7.4，用NaOH调整），将配置好的缓冲溶液置于4℃冰箱备用。 4.4 电极的制备 称取2.0 g 琼脂放于50 ml 离心管中，加入3 mol/L KCl 溶液50 ml，置于100℃水浴锅中加热直至 离心管中液体呈透明粘稠状，无气泡后取出。用5 ml 注射器吸取适量KCl-琼脂溶液，向电极套管尖部 注射5mm~10 mm长度的KCl-琼脂，选出电极套管中KCl-琼脂部分无气泡且长度适宜的备用，置于3mol/L KCl溶液中存放。 4.5 95% O2 + 5% CO2 混合气体：纯度 99.99%以上。 5 仪器和设备 5.1 Ussing chamber 装置：循环水浴槽、尤斯灌流室（P2300）、样品固定环夹片（P2300）、数据采 集器、多通道电压-电流钳（VCC MC6）。 5.2 分析天平：感量 0.0001。 5.3 恒温循环水浴槽：Rt～90℃。 5.4 计算机：windows 操作系统。 5.5 pH 计。 5.6 移液枪：5ml。 6 测定 6.1 样品采集与处理 6.1.1 样品采集 2 在室温条件下动物屠宰后15 min之内采集瘤胃腹囊上皮组织约2×2 cm 大小，用已预热好的缓冲溶 液冲洗干净，置于充满95% O2和5% CO2混合气体的保温瓶中迅速带回实验室。 2 DB15/T 1531—2018 6.1.2 样品处理 2 在实验室迅速剥离瘤胃上皮组织肌层，并剪成1×1cm 放于固定环夹片中固定，待测。注意上皮组 织样品从屠宰到上机测定，时间不能超过45 min。 6.2 测定 6.2.1 开机 6.2.1.1 开启恒温水浴槽，将温度设定在 42℃。 6.2.1.2 开启多通道电压/电流钳电源，保持仪器预热 15 min。 6.2.1.3 开启计算机及数据采集器。 6.2.2 预热缓冲溶液 将缓冲溶液预热至37℃。 6.2.3 安装电极 将制作好的电极插入所用通道的Ussing Chamber电极孔中，电极顺序从右到左依次为白、黑、黑、 白（黑色为电压电极，白色为电流电极）。 电极安装结束，需把样品固定环夹片插入到Ussing Chamber的两个半室中间，拧紧侧面旋钮，以防 漏液。 6.2.4 加缓冲溶液 向Ussing Chamber两侧小室中各缓慢加入5 ml缓冲溶液,并由恒温循环水浴槽维持在37℃~39℃。 6.2.5 持续通入混合气体 向Ussing Chamber两侧小室中通入95% O2和5% CO2的混合气体，注意控制流速，调节两半室流出的 气泡使其呈念珠状，且频率相同。 6.2.6 补偿电压、电流 将仪器MASTER OVERRIDE开关调至“ON”，FUNCTION 键调至“OPEN”，METER键调至“V”，对每个 通道进行测试，此时表头显示电压电极对之间的差值。该偏差不应超1 mV，表明电压电极状态正常。在 电极偏移值不超过1 mV的前提下，将OFFSET键调至与表头偏移值相反的极性，调节OFFSET键下的刻度旋 钮直至表头读数为 0.0，完成电压补偿。 将METER键调至“I”，按住PUSH TO ADJ键，观察表头显示的电流值，其值在60μ A~68μ A范围内表 明电流电极正常。在电极状态正常的前提下，再将METER 键切换至“V”，一手按住PUSH TO ADJ键，一 手旋转FLUID RESCOMP上面的刻度旋钮，直至表头读数为 0.0，完成电流补偿。 6.2.7 安装组织样品 2 排空两个半室中的缓冲溶液，取下样品固定夹片，擦干，并除去两个半室之间残留的液体。将1×1cm 瘤胃上皮组织垂直固定于夹片的钉子上，置于Ussing Chamber 的两个半室中间，其中黏膜面朝向A室， 浆膜面朝向B室。拧紧侧面旋钮。再向每个半室重新加入5 ml的预热缓冲溶液。 3 DB15/T 1531—2018 6.2.8 开启电脑记录 打开各通道的REM开关，同时打开电脑中Acquire and Analyze软件，按下电脑界面中Reference按 钮，确定每个通道显示的补偿值是合理的（通道零点值≤0.1显示黑色，可用；通道零点值在0.1~1.0 之间显示黄色，较黑色次之，但也可用；通道零点值﹥1.0显示红色，不可用，需要重新调整），点击 对话框中的方形按钮，确定。 6.2.9 平衡、记录参数 平衡约20 min，待电流曲线平缓稳定后，开始记录每个通道Isc、Gt和PD值。 6.3 平行试验 按上述步骤对同一样品进行3个通道的平行测定。 7 测定结果 7.1 结果表示 平行测定结果用算术平均値表示，保留到小数点后一位。 7.2 重复性 在重复性条件下同一样品获得的测定结果的绝对差值不得超过算术平均値的10%。 4 DB15/T 1531—2018 AA 附 录 A （资料性附录） Ussing chamber 装置 图A.1 Ussing chamber 装置 _________________________________ 5