ICS 65.150 B 51 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1835—2019 双斑东方鲀种质标准 Twospot puffer germplasm standard 2019 - 04 - 18 发布 福建省市场监督管理局 2019 - 07 - 18 实施 发 布 福 建 省 地 方 标 准 双斑东方鲀种质标准 DB35/T 1835—2019 * 2019 年 4 月第一版 2019 年 4 月第一次印刷 DB35/T 1835—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 学名和分类地位 .................................................................... 1 5 主要形态特征 ...................................................................... 1 6 生长与繁殖 ........................................................................ 2 7 遗传学特征 ........................................................................ 3 8 检测方法 .......................................................................... 4 9 判定规则 .......................................................................... 5 附录 A（规范性附录） 缓冲液配制方法 .................................................. 6 I DB35/T 1835—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由福建省海洋与渔业局提出并归口。 本标准起草单位：福建省水产研究所、漳浦县佛昙镇河豚鱼协会。 本标准主要起草人：刘波、钟建兴、苏国强、刘智禹、方民杰、李雷斌、李正良、郑雅友、戴云峰。 II DB35/T 1835—2019 双斑东方鲀种质标准 1 范围 本标准规定了双斑东方鲀[Takifugu bimaculatus (Richardson,1845)]的术语和定义、学名和分类 地位、主要形态特征、生长与繁殖、遗传学特征、检测方法以及判定规则。 本标准适用于双斑东方鲀的种质鉴定与检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 8588 渔业资源基本术语 GB/T 18654.2 养殖鱼类种质检验 第2部分：抽样方法 GB/T 18654.3 养殖鱼类种质检验 第3部分：性状测定 GB/T 18654.6 养殖鱼类种质检验 第6部分：繁殖性能的测定 GB/T 18654.12 养殖鱼类种质检验 第12部分：染色体组型分析 3 术语和定义 GB/T 8588界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 皮刺 prickle 鱼皮上的棘状骨化物。 4 学名和分类地位 4.1 学名 双斑东方鲀 [Takifugu bimaculatus (Richardson,1845)]。 4.2 分类地位 脊椎动物亚门（Vertebrata），硬骨鱼纲（Osteichthyes），鲀形目（Tetraodontiformes），鲀 科（Tetraodontidae），东方鲀属（Takifugu）。 5 主要形态特征 5.1 5.1.1 外部形态 外形 1 DB35/T 1835—2019 体亚圆筒形，头胸部粗圆，躯干后部渐细，尾柄圆椎状。眼较小，侧上位，眼间隔宽，稍圆突。鼻 瓣呈卵圆形突起，位于眼前缘上方；鼻孔每侧2个，紧位于鼻瓣内外侧。鳃孔中大，侧中位，呈浅弧斜 形，位于胸鳍基底前方。 体背面自鼻孔后方至背鳍基底，腹面自鼻孔或眼下方至肛门前方均被较强皮刺，吻部、体侧面和尾 部光滑无刺，身体无鳞。 体背面浅褐色，胸鳍浅黄褐色，背鳍、臀鳍和尾鳍均为黄橙色。项部至尾柄上分布十余条向后下方 斜行的深褐色圆弧形横纹，背鳍基部有一黑褐色小斑点，其周围有同圆形黑褐色细条纹。胸鳍后上方体 侧各有一黑色斑点。双斑东方鲀的外形见图1。 图1 5.1.2 双斑东方鲀外形 可数性状 背鳍鳍式：D.13～14；臀鳍鳍式：A.11～13；胸鳍鳍式：P. 15～18；尾鳍鳍式：C.10；鳃耙数： 8～9。 5.1.3 可量性状 双斑东方鲀可量性状比例值见表1。 表1 5.2 双斑东方鲀可量性状比例值 体长/体高 体长/头长 头长/吻长 头长/眼径 尾柄长/尾柄高 2.7～3.8 2.6～3.1 2.0～2.4 5.0～7.4 1.2～1.8 内部构造 牙齿与上下颌骨愈合，形成4个大牙板，中央缝显著。 头骨骨质硬而细密，中筛骨稍长而稍窄，额骨长大于额骨宽，眶上缘稍短，额骨外缘短于前耳骨外 缘，额骨外缘与蝶耳骨前缘形成锐角。 体腔大，腹腔淡红色，鳔大，有气囊。 6 生长与繁殖 6.1 生长 年龄与体长、体重的关系见表2。 2 DB35/T 1835—2019 表2 双斑东方鲀各年龄阶段体长与体重实测值范围 年龄（龄） 1 2 3 4 体长（cm） 12～18 17～22 20～26 25～34 体重（g） 64～260 240～510 460～650 610～820 6.2 繁殖 6.2.1 性成熟年龄 雌鱼最小性成熟年龄3龄，雄鱼最小性成熟年龄2龄。 6.2.2 繁殖季节 雌鱼产卵期为3月至5月，4月为产卵盛期，产卵水温为15 ℃～25 ℃。 6.2.3 生殖力 为一次性产卵型鱼类，卵巢每年性成熟1次，在性成熟度相同的情况下一般亲鱼怀卵量随个体增大 5 5 5 5 而增多，绝对怀卵量为1.0×10 ～4.0×10 粒，相对怀卵量为2.2×10 ～5.2×10 粒每千克。 6.2.4 卵子特征 受精卵为粘性沉性卵，椭球形，淡黄色，卵膜厚不透明，卵径0.9 mm～1.0 mm，多油球。 7 遗传学特征 7.1 细胞遗传学特征 双斑东方鲀体细胞染色体数2n=44，染色体臂数（NF）=62，核型公式12m+6sm+26t，染色体组型如 图2所示。 图2 双斑东方鲀染色体组型 7.2 分子遗传学特征 随机引物S6（GTCCACACGG）和S12（GTTTCGCTCC）PCR扩增的特征产物，片段大小为500 bp～2 100 bp， 如图3所示。 3 DB35/T 1835—2019 a）引物 S6（GTCCACACGG）（5‘-3’）PCR 扩增产物 b）引物 S12（GTTTCGCTCC） （5‘-3’）PCR 扩增产物 说明： M——Marker 2000。 图3 8 双斑东方鲀基因组 DNA 的 RAPD 电泳图谱 检测方法 8.1 抽样 按GB/T 18654.2的规定执行。 8.2 性状测定 按GB/T 18654.3的规定执行。 8.3 繁殖性能测定 按GB/T 18654.6的规定执行。 8.4 染色体组型检测 按GB/T 18654.12的规定执行。 8.5 4 基因组 DNA 的随机引物扩增（RAPD）分析 DB35/T 1835—2019 8.5.1 样品制备 于样品尾部取肌肉组织50 mg，置研钵中充分研磨，加入500 L抽提缓冲液（100 mmol/mL Tris-HCl， pH 8.0；0.1 mol/L乙二胺四乙酸，pH 8.0），再加入终浓度分别为0.5%的SDS和200 g/mL的蛋白酶K， 55 ℃水浴消化，每10 min缓摇一次，3 h左右消化完全后，冷却经酚、酚：氯仿（1:1）、氯仿各抽提 一次，2倍体积预冷的无水乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗涤，晾干后用适量超纯水溶解，65 ℃灭活10 min 后，-4 ℃保存备用（缓冲液配制方法见附录A）。 8.5.2 RAPD 反应 RAPD反应总体积为25 L，包括10ｘPCR反应缓冲液2.5 L（成分：100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，1.315 mg/mL BSA，0.01% Gelatin，pH8.4）；基因组DNA（10 g/mL）2 L； TaqDNA聚合酶1U；dNTP（1 mmol/L）2.5 L；各引物（10 mol/L）0.5 L；用超纯水补足体积至25 L。 样品在PCR扩增仪上进行扩增：94 ℃变性5 min；94 ℃ 1 min，36 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，45个循环； 72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。 8.5.3 电泳和成像 取PCR扩增产物5 L在1.4%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，电压5 V/cm，当加样缓冲液中的溴酚蓝迁 移至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源。琼脂糖凝胶在0.5 g/mL的EB溶液染色10 min～30 min后， 用全自动凝胶成像系统紫外成像并拍照，通过该系统计算扩增产物的分子量。 9 判定规则 检测结果不符合第5章以及7.1中要求的，则判定为不合格项；有不合格项的样品为不合格样品。 5 DB35/T 1835—2019 AA 附 录 A （规范性附录