ICS 65.020.20 B 04 DB 12 天 津 市 地 方 标 准 DB12/T 843—2018 绿豆源成分检测 定性 PCR 法 Mung bean-derived ingredients detection—Qualitative PCR method 2018 - 11 - 07 发布 天津市市场和质量监督管理委员会 2018 - 12 - 01 实施 发 布 DB12/T 843—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由天津市农村工作委员会提出并归口。 本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、浙江省农业科学院农产品质量标准研究 所、天津市东丽区产品质量监督检验所。 本标准主要起草人：兰青阔、陈笑芸、王成、赵新、兰璞、王永、王庆平、汪小福、黄凤军、秦志 扬。 I DB12/T 843—2018 绿豆源成分检测 定性 PCR 法 1 范围 本标准规定了绿豆源成分的定性PCR检测方法的原理、试剂和材料、仪器、分析步骤、结果分析和 表述、检出限。 本标准适用于绿豆源成分的定性PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 绿豆源成分特异性序列 specific sequence of Mung bean-derived ingredients 本标准绿豆源成分特异性序列位于绿豆第5号染色体。 4 原理 根据绿豆源特异性序列设计特异性引物，对试样进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期的DNA片段， 判断样品中是否含有绿豆源成分。 5 试剂和材料 5.1 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。 5.2 1 mol/L 氢氧化钠溶液：在 160 mL 水中加入 8.0 g 氢氧化钠（NaOH），溶解后，冷却至室温，再 加水定容到 200 mL。 5.3 CTAB-A buffer：将 4 g 十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）、16.4 g 氯化钠（NaCl）、3.15 g 三羟 甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）、1.5 g 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）依次加入到 100 mL 无菌去离 子水中，用 1 mol/L 氢氧化钠溶液（见 5.1）调 pH 至 8.0，加水定容至 200 mL。在 103.4 kPa（121 ℃） 条件下灭菌 15 min。 5.4 CTAB-B buffer：将 1 g 十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）、0.5 g 氯化钠（NaCl）、依次加入到 100 mL 无菌去离子水中，用 1 mol/L 氢氧化钠溶液（见 5.1）调 pH 至 8.0，加水定容至 200 mL。在 103.4 kPa （121 ℃）条件下灭菌 15 min。 1 DB12/T 843—2018 5.5 1.2 mmol/L NaCl 溶液：将 7 g 氯化钠（NaCl）溶于 100 mL 无菌去离子水中。在 103.4 kPa（121 ℃） 条件下灭菌 15 min。 5.6 70%乙醇：将 737 mL 95%乙醇，加水定容至 1000 mL。 5.7 500 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液（pH 8.0）：称取 18.6 g 乙二胺四乙酸二钠， 加入 70 mL 水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液（见 5.1）直至 EDTA-Na2 完全溶解，用氢氧化钠溶液（见 5.1） 调 pH 至 8.0，加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa（121 ℃）条件下灭菌 20 min。 5.8 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）溶液（pH 8.0）：称取 121.1 g 三羟甲基氨基甲烷 溶解于 800 mL 水中，用盐酸调 pH 至 8.0，加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121 ℃）条件下灭菌 20 min。 5.9 TE 缓冲液（pH 8.0）：分别量取 10 mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（见 5.7）和 2 mL 乙二胺四 乙酸二钠溶液（见 5.6），加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa（121 ℃）条件下灭菌 20 min。 5.10 琼脂糖。 5.11 10 g/L 溴化乙锭（EB）溶液：称取 1.0 g 溴化乙锭，溶解于 100 mL 水中，避光保存。溴化乙锭 有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废弃物。根据需要可选择其他效果相当的核 酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂。 5.12 50×TAE 缓冲液：称取 242.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris），先用 500 mL 水加热搅拌溶解后， 加入 100 mL 乙二胺四乙酸二钠溶液（见 5.6），用冰乙酸调 pH 至 8.0，然后加水定容到 1 000 mL。使 用时用水稀释成 1×TAE。 5.13 加样缓冲液：称取 250.0 mg 溴酚蓝，加入 10 mL 水，在室温下溶解 12 h；称取 250.0 mg 二甲 基苯腈蓝，加 10 mL 水溶解；称取 50.0 g 蔗糖，加 30 mL 水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至 100 mL，在 4 ℃下保存。 5.14 DNA 分子量标准：可以清楚区分 100 bp～1 000 bp 的 DNA 片段。 5.15 dNTPs 混合溶液：将浓度为 10 mmol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液等 体积混合。 5.16 Taq DNA 聚合酶、PCR 扩增缓冲液及 25 mmol/L 氯化镁（MgCl2）溶液。 5.17 绿豆源特异性引物： ——Mungbean_470bp_F：5′-TGAATGAGAGTGGTGTGAGTGAGA-3′； ——Mungbean_470bp_R：5′-CCGCGAGTATTATTGATGGTAGG-3′； ——预期扩增片段大小为 470 bp，参见附录 A。 5.18 引物溶液：用 TE 缓冲液（见 5.8）或水分别将上述引物稀释到 10 µmol/L。 5.19 石蜡油。 5.20 DNA 提取试剂盒。 5.21 定性 PCR 试剂盒。 5.22 PCR 产物回收试剂盒。 6 仪器 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 分析天平：重感 0.1 g 和 0.1 mg。 PCR 扩增仪：升降温速度> 1.5 ℃/s，孔间温度差异< 1.0 ℃。 电泳槽、电泳仪等电泳装置。 紫外透射仪。 凝胶成像系统或照相系统。 重蒸馏水发生器或超纯水仪。 2 DB12/T 843—2018 6.7 其他相关仪器和设备。 7 分析步骤 7.1 DNA 提取 称取100 mg样品于2.0 mL离心管中，加入300 μ L无菌去离子水，充分混匀；加入500 μ L CTAB-A buffer，充分混匀；加入20 μ L蛋白酶K（20 mg/mL），充分混匀，65 ℃水浴1 h，间期混匀三次；加 入20 μ LRNase A（10 mg/mL），充分混匀，65 ℃水浴10 min；16 000 g离心10 min；转移上清液至新 的2.0 mL离心管中，加入500 μ L三氯甲烷，混匀30 s；16 000 g离心10 min；转移500 μ L上清液至新 的2.0 mL离心管中，加入500 μ L 三氯甲烷，混匀30 s；16 000 g离心5 min，转移上清液至新的2.0 mL 离心管中，加入2倍体积的CTAB-B buffer，吹打混匀，室温静置60 min；16 000 g离心5 min，弃上清 液；沉淀中加入350 μ L 1.2 mmol/L NaCl，再加入350 μ L三氯甲烷，混匀30 s；16 000 g离心10 min， 转移上清液至新的洁净2.0 mL离心管中；加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀；16 000 g离心10 min， 弃上清液；加入500 μ L 70%乙醇，颠倒混匀；16 000 g离心10 min，弃上清液；室温静置至管内水分 完全蒸发，加入100 μ L无菌去离子水溶解沉淀，所得溶液即为绿豆DNA，-20 ℃贮存备用。 7.2 DNA 的浓度和质量 将DNA适当稀释或浓缩，使其OD260值在0.1～0.8的区间内，测定并记录其在260 nm和280 nm的吸光 度。以1个OD260值相当于50 mg/L DNA浓度来计算纯化DNA的浓度，并进行DNA凝胶电泳检测DNA完整性。 DNA溶液的OD260/OD280值应在1.7～2.0之间，或质量能复合检测要求。 7.3 PCR 扩增 7.3.1 试样 PCR 反应 7.3.1.1 每一个试样 PCR 反应设置 3 次重复。 7.3.1.2 在 PCR 反应管中按附录 B 依次加入反应试剂，混匀，再加 25 μ L 石蜡油（有热盖设备的 PCR 仪可不加）。 7.3.1.3 将 PCR 管放在离心机上，500 g～3000 g 离心 10 s，然后取出 PCR 管，放入 PCR 仪中。 7.3.1.4 进行 PCR 扩增。反应程序为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30s，72℃延 伸 30 s，共进行 35 次循环，72 ℃ 延伸 7 min。（可根据仪器和试剂要求对反应参数作适当调整。） 7.3.1.5 反应结束后取出 PCR 管，对 PCR 产物进行电泳检测。 7.3.2 对照 PCR 扩增 7.3.2.1 在试样 PCR 扩增的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。 7.3.2.2 以绿豆材料提取的 DNA 作为阳性对照；以非绿豆材料 DNA 作为阴性对照；以水作为空白对照。 7.3.2.3 除模板外，其余组分与 PCR 扩增与 7.2.1 相同。 7.4 PCR 产物电泳检测 按20 g/L的质量浓度称取琼脂糖，加入1×TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液，每100 mL 琼脂糖溶液中加入5 μ L EB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固合成 凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取12 μ L PCR产物与3 μ L加样缓冲液混合后 加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样空中加入DNA分子量标准，接通电源在2 V/cm～5 V/cm条件下电 泳检测。 3 DB12/T 843—2018 7.5 凝胶成像分析 电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像