ICS 65.020.20 B 04 DB 12 天 津 市 地 方 标 准 DB12/T 838—2018 辣椒种子纯度 SSR 分子标记鉴定方法 Method of identifying seed purity of pepper by using SSR-based marker 2018 - 11 - 07 发布 天津市市场和质量监督管理委员会 2018 - 12 - 01 实施 发 布 DB12/T 838—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由天津市农村工作委员会提出并归口。 本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市蔬菜研究中心、黑龙江省农业科 学院农产品质量安全研究所。 本标准主要起草人：兰青阔、吕敬刚、赵新、王成、兰璞、焦荻、高素燕、陈锐、关海涛、张耀中、 焦贺敏。 I DB12/T 838—2018 辣椒种子纯度 SSR 分子标记鉴定方法 1 范围 本标准规定了辣椒种子纯度SSR分子标记鉴定方法的原理、仪器设备及试剂、方法步骤、纯度计算。 本标准适用于辣椒单交种的纯度鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标 准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 种子纯度 seed purity 种子在SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占鉴定样品种子 粒数的百分率表示，以反映某品种特征特性的一致性程度。 3.2 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction(PCR) 一种在体外通过酶促反应扩增特异DNA片段的技术。 3.3 简单重复序列 simple sequence repeat(SSR) 由几个核苷酸（1～6个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100～200）的串联 重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。 3.4 分子标记 molecular marker 以蛋白质、核酸分子的多态性为基础，鉴定生物在遗传上的差异。 4 原理 SSR分布于辣椒整个基因组，每个位点上重复单位的数目不同造成了品种间的多态性，利用PCR技术 将多态的SSR扩增出来，通过电泳检测扩增产物，利用电泳图谱进行辣椒种子纯度鉴定。 5 仪器设备及试剂 1 DB12/T 838—2018 5.1 仪器设备 PCR仪；测序电泳槽；水平电泳槽；高压电泳仪（3000 V，400 mA，400 W）；万分之一电子天平； 微量加样器；磁力搅拌器；台式离心机；紫外-可见成像系统；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅； pH计等。 5.2 试剂 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；十二烷基硫酸 钠（SDS）；氯化钠（NaCl）；氢氧化钠（NaOH）；硼酸；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青FF；甲叉 双丙烯酰胺；丙烯酰胺；尿素；亲和硅烷；剥离硅烷；无水乙醇；四甲基乙二胺（TEMED）；过硫酸铵； 2+ 冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液（37%）；Taq DNA聚合酶（含Mg 的10×PCR缓冲液）；四种脱氧核糖核苷酸 （dNTPs）；SSR引物；琼脂糖；Gold View染料；定性PCR试剂盒；DNA提取试剂盒；实验用水为重蒸馏 水或符合GB/T 6682规定的一级水等。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。 5.3 溶液配制 相关溶液配制方法见附录A。 6 方法步骤 6.1 取样 检测样品的分样和保存，应符合GB/T 3543.2的规定，从中随机取100粒以上种子，取其父母本材料 各10份。 6.2 单粒种子的 DNA 提取 6.2.1 样品预处理 在玻璃培养皿底部垫上一层厚度约3mm的棉花或滤纸，用水浸湿后均匀地撒上检测样品，再于表面 覆盖一层纱布，置于光照培养箱中。培养条件为16h 35℃光照培养，8h 28℃暗培养，待种子长出子叶 后备用。 6.2.2 DNA 提取 取单株幼苗子叶，放入1.5 mL离心管中，在液氮中研碎，放入1.5 mL离心管中。将DNA提取液预热 到65 ℃，每管放入400 µL混合样品，将离心管置于65 ℃金属浴或水浴锅中，保温30 min后取下，向 离心管中加入400 µL 24:1氯仿-异戊醇（V:V），振荡混匀。10 000 g离心10 min。将上清液200 µL转 入另一支1.5 mL离心管，加入400 µL -20 ℃预冷无水乙醇沉淀DNA。10 000 g离心1 min，弃上清液， 加入500 µL乙醇——乙酸铵溶液，6000 g离心5 min收集沉淀。加入100 µL TE（pH8.0）溶液溶解DNA。 6.2.3 DNA 的浓度和质量 将DNA适当稀释或浓缩，使其OD260值在0.1～0.8的区间内，测定并记录其在260 nm和280 nm的吸光 度。以1个OD260值相当于50 mg/L DNA浓度来计算纯化DNA的浓度，并进行DNA凝胶电泳检测DNA完整性。 DNA溶液的OD260/OD280值应在1.7～2.0之间，或质量能复合检测要求。 6.3 分子标记筛选 2 DB12/T 838—2018 用22对核心引物进行PCR反应，扩增双亲及送检样品各10份DNA，筛选带型清晰，双亲间差异大，互 补性好的引物作为纯度鉴定的SSR分子标记。 6.4 PCR 扩增 6.4.1 反应体系 2+ 总体积10 μ L，包括5 μ L超纯水、1 μ L含Mg 的10×PCR缓冲液、0.8 μ L dNTPs（2.5 mmol/L）、 0.6 μ L SSR引物（10 μ mol/L）、1 μ L Taq DNA聚合酶（2.5 U/μ L）、1 μ L DNA（30～50 ng/μ L）， 混匀。 6.4.2 反应程序 94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，按附录B推荐的引物退火温度退火45 s，72 ℃延伸45 s，循 环35次；72 ℃延伸10 min；-20 ℃保存备用。 6.5 变性聚丙烯酰氨凝胶电泳 按照附录C规定的方法，进行4.5%变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳检测扩增产物。 7 纯度计算 以筛选出来的SSR分子标记为引物扩增送检样品的DNA，通过带型统计，用具有本品种特异带型的种 子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示纯度，计算公式如下： 纯度%  具有本品种特异带型的种子粒数  100% 检测样品种子粒数 3 DB12/T 838—2018 AA 附 录 A （规范性附录） 溶液配制 A.1 DNA提取液 含有200 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），250 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA，0.5%SDS，经高压蒸 汽灭菌后使用。 A.2 引物稀释 按照引物合成单的说明先配制100 μ mol/L的储存液，取适量储存液稀释40倍，配制浓度为2.5 mmol/L的使用液。 A.3 6×变性上样缓冲液 去离子甲酰胺49 mL，0.5 mol/L的EDTA溶液（pH 8.0）1mL，溴酚蓝0.125 g，二甲苯青0.125 g。 A.4 10×电泳缓冲液 Tris 108g，硼酸55 g，0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）溶液37 mL，定容至1000 mL。 A.5 40%丙烯胺胶 丙烯酰胺190 g，甲叉双丙烯酰胺10 g，定容至500 mL。 A.6 A.6 4.5%丙烯胺胶 尿素450 g，10×电泳缓冲液100 mL，40%丙烯酰胺胶112.5 mL，定容至1000 mL。 A.7 1%亲和硅烷 20 μ L亲和硅烷，20 μ L冰醋酸，加无水乙醇至2 mL。现用现配。 A.8 2%剥离硅烷 1 mL剥离硅烷，49 mL三氯甲烷。 A.9 10%过硫酸铵 0.1 g过硫酸铵溶于1 mL超纯水中。现用现配。 4 DB12/T 838—2018 A.10 固定液 200 mL冰醋酸，定容至2000 mL。 A.11 染色液 4 g硝酸银，定容至2000 mL。 A.12 显影液 2000 mL蒸馏水中加入40 g氢氧化钠和10 mL甲醛。 5 DB12/T 838—2018 BB 附 录 B （规范性附录） 22 对核心引物 22对核心引物见表B.1。 表B.1 22 对核心引物表 序号 引物 1 LJ-1 2 LJ-2 3 LJ-3 4 LJ-4 5 LJ-5 6 LJ-6 7 LJ-7 8 LJ-8 9 LJ-9 10 LJ-10 11 LJ-11 12 LJ-12 13 LJ-13 14 LJ-14 15 LJ-15 16 LJ-16 17 LJ-17 18 LJ-18 19 LJ-19 20 LJ-20 21 LJ-21 22 LJ-22 引物序列（5’—3’） F:AGCCATGGCAGAATTGGAAG R:TTCAGCAGGTTCTGGTTCTGGT F:CGCATCTACATCAAGAATCAACCA R:GATGTAGAACAAGGAAGCAGGG F:GAUGAATTTTGGAGCCACACAC R:AGGTGAAATGGGCAGTGGTAGA F:CAAAACCAAATAGGTCCCCC R:CGCGCAATAATTCAATATCG F:TGCGAGTACCGAGTTCTTTCTAG R:GGCAGTCCTGGGACAACTCG F:ATGTCGCTCGCAATTTCACT R:CGTAGGGAGGAGCGATAGAG F:CGGCCAAATTATTTTTCCCAGT R:TTCCCATAGTTGAAGAUCCTGC F:TACGGTTCCTCATCCCAGAAGA R:AGGATGACCAATGTTTTGCCTC F: CCCTTCCCTTTTCTCCCTTCTT R:CAGAAACAGCCATTGATGATG F:GCGGCCTTTTGATTCATACAAT R:CGTTTTACTGCCCTATCTGCTTG F:GCACGAGUCAACAAAAGAGAAT R:CGCTGAUCGAGACAGAGAGAG F:TCCCATTTCGCAAGAAAGAAAA R:TCCGATACAGCTGCAGTAGAAAA F,TCAGCGATTAAGAATGCGATTG R:CCAAATTGCCCTCTCTCTTC